劉 洋 祝慧慧 馮春梅 俞 波

吡格列酮對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠NF-kB和PARP表達(dá)的影響

劉 洋1?；刍?馮春梅1俞 波2

目的探討吡格列酮對(duì)大鼠腦缺血/再灌注梗死區(qū)炎癥介質(zhì)NF-κB和PARP表達(dá)的影響。方法采用線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型，動(dòng)物分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和吡格列酮組。觀察各組大鼠的神經(jīng)功能損害NSS評(píng)分，應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)梗死區(qū)NF-κB和PARP基因的表達(dá)。結(jié)果吡格列酮組較模型組NSS評(píng)分顯著降低（P＜0.05），梗死區(qū)NF-κB和PARP mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論吡格列酮可能通過(guò)下調(diào)炎癥介質(zhì)NF-κB和PARP表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腦缺血損傷神經(jīng)功能恢復(fù)。

吡格列酮；腦缺血/再灌注；NF-κB；PARP

吡格列酮是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferators activated receptor γ, PPARγ）的合成激動(dòng)劑，是新一代噻唑烷二酮類(lèi)代表性藥物，其作為胰島素敏感因子[1]，已廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的臨床治療，療效顯著。近年來(lái)有研究者發(fā)現(xiàn)[2,3]，吡格列酮還可用于腦血管疾病的治療，White等[2]通過(guò)meta分析發(fā)現(xiàn)在許多大鼠腦梗死模型實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)靜脈注射或腦室內(nèi)注射吡格列酮能夠顯著降低腦梗死體積，促進(jìn)腦神經(jīng)功能恢復(fù)，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和DNA修復(fù)酶PARP能夠協(xié)同調(diào)節(jié)多種炎癥因子轉(zhuǎn)錄，在腦缺血損傷炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此，本研究通過(guò)觀察吡格列酮對(duì)腦梗死后炎癥因子NF-κB和PARP基因表達(dá)的影響，探討吡格列酮促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑鹽酸吡格列酮片（煙臺(tái)方正制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20070229），尼莫地平注射液（河北永豐藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13021882）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol和Taq酶購(gòu)自Takara公司，引物合成購(gòu)自大連寶生物公司，NF-κB上游引物：AAGAAGCGAGACCTGGA，下游引物CCGGAACA CAATGGCCA；PARP上游引物：CCAGGGTCTTCG GATAG，下游引物GCGTGCTTCAGTTCATACA；β-actin上游引物GGGTATGGGTCAGAAGGA，下游引物GCTGGGGTGTTGAAGGTC。

1.2 動(dòng)物造模及分組健康成年SD大鼠，體重160～180g，由哈醫(yī)大動(dòng)物中心提供[SCXK（黑）許可證號(hào)：2007D200]。線栓改良法制備大腦中動(dòng)脈缺血大鼠模型，大鼠隨機(jī)分為4組，每組9只，分別為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組（20mg/kg）、吡格列酮組（20mg/kg）。尼莫地平組、吡格列酮組從造模前7d開(kāi)始每日一次灌胃給藥，假手術(shù)組、模型組給予等體積生理鹽水。根據(jù)Culman等[3]的報(bào)道，本研究采用吡格列酮為最大有效劑量。

1.3 NSS法檢測(cè)再灌注96h后，依據(jù)NSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)功能和感覺(jué)功能，功能缺損最嚴(yán)重時(shí)得分為22分，無(wú)功能損傷為0分。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)提取各組腦組織內(nèi)總RNA，參照PrimeScript? RT-PCR說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR檢測(cè)及熒光定量分析。通過(guò)2-ΔΔCt方法進(jìn)行樣本相對(duì)定量比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以（±s）表示，各組間比較用LSD分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損害評(píng)分與假手術(shù)組[（0）分]比較，模型組[（11.22±1.06）分]、尼莫地平組[（9.25±0.79）分]和吡格列酮組[（7.72±0.94）分]NSS評(píng)分顯著增加，差異有顯著性（P＜0.01）。與模型組和尼莫地平組比較，吡格列酮組NSS評(píng)分顯著降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=91.27，P＜0.05）。

2.2 RT-qPCR檢測(cè)模型組PARP和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)較假手術(shù)組顯著增多（P=0.000，P=0.000），模型組PARP和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)均與尼莫地平組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.124，P=0.598）。與模型組比較，吡格列酮組PARP和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)均顯著降低（P=0.000，P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。

表1 梗死區(qū)PARP和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)(2-ΔΔCt值,±s,n=9)

表1 梗死區(qū)PARP和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)(2-ΔΔCt值,±s,n=9)

注：*與假手術(shù)組比較，P＜0.01；△與模型組比較，P＜0.01

組別 PARP NF-κB假手術(shù)組 0 0模型組 0.3587±0.045*0.875±0.061*尼莫地平組 0.315±0.029*0.856±0.026*吡格列酮組 0.175±0.025*△0.649±0.053*△F86.710 274.320P0.000 0.000

3 討論

噻唑烷二酮類(lèi)（Thiazolidinediones, TZDs）是PPARγ合成激動(dòng)劑，PPARγ是核內(nèi)受體超家族中的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。吡格列酮、羅格列酮和曲格列酮[1]均為噻唑烷二酮類(lèi)代表性藥物，吡格列酮作為胰島素敏感因子已廣泛應(yīng)用于臨床2型糖尿病的治療。臨床研究發(fā)現(xiàn)[3]，吡格列酮治療能顯著降低心肌梗塞、腦梗死和2型糖尿病的死亡率及并發(fā)癥的發(fā)生，吡格列酮還能夠促進(jìn)糖尿病合并腦梗死患者的神經(jīng)功能恢復(fù)，其在短期內(nèi)即可顯效，且無(wú)心力衰竭、水腫和體重增加等副作用。研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮治療能夠顯著降低大鼠腦梗死體積，促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)，且其治療無(wú)時(shí)間依賴性。White等[2]發(fā)現(xiàn)腦缺血后吡格列酮治療組在任何時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較，收縮期和舒張期的血壓、心率和其它生理學(xué)變量均無(wú)顯著差異，在體內(nèi)未表現(xiàn)明顯毒性，安全可靠。本研究發(fā)現(xiàn)與模型組和對(duì)照組比較，吡格列酮組NSS評(píng)分顯著降低，再次證實(shí)了吡格列酮能夠促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)。

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB能夠啟動(dòng)腦缺血后炎癥反應(yīng)，影響炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，放大炎癥效應(yīng)。而DNA修復(fù)酶PARP是NF-κB的共活化物，兩者在炎癥趨化過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用，誘導(dǎo)靜止的小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向腦梗死區(qū)遷移，加劇早期腦缺血的局部損傷，導(dǎo)致梗死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的死亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組梗死區(qū)NF-κB和PARP基因表達(dá)顯著增高，而使用吡格列酮可顯著下調(diào)NF-κB和PARP基因表達(dá)，提示吡格列酮能夠抑制與NF-κB和PARP相關(guān)的炎癥反應(yīng)。從而推測(cè)其機(jī)制可能與吡格列酮通過(guò)PPARγ途徑抑制NF-κB和PARP等前炎癥因子的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[3]。

綜上所述，吡格列酮治療能促進(jìn)腦缺血損傷后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，其作用機(jī)制可能與吡格列酮下調(diào)腦梗死區(qū)PARP和NF-κB的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[1] Kataoka Y, Yagi N, Kokubu N, et al. Effect of pretreatment with pioglitazone on reperfusion injury in diabetic patients with acute myocardial infarction [J]. Circ J, 2011,75(8)：1968-1974.

[2] White A, Murphy A.Administration of thiazolidinediones for neuroprotection in ischemic stroke： a pre-clinical systematic review[J]. J.Neurochem, 2010,115(10)：845-853.

[3] Culman J, Nguyen-Ngoc M, Glatz T, et al. Treatment of rats with pioglitazone in the reperfusion phase of focal cerebral ischemia：A preclinicalstroke trial[J]. Exp Neurol, 2012,238(2)： 243-253.

R743

A

1673-5846(2013)01-0211-02

1 黑龍江牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011

2 浙江省諸暨市中醫(yī)院胸外科，浙江紹興 311800