劉曼 張強(qiáng) 周立偉 莫安春 李小玉 李吉東

[摘要] 目的 觀察載銀納米羥磷灰石/二氧化鈦/聚酰胺66（Ag-nHA-nTiO2/PA66）納米抗菌復(fù)合膜的物理結(jié)構(gòu)及對(duì)成骨樣細(xì)胞生物相容性的影響。方法 掃描電鏡（SEM）和光學(xué)顯微鏡下觀察Ag-nHA-nTiO2/PA66膜和膨體聚四氟乙烯（e-PTFE）膜的結(jié)構(gòu)，在兩組膜材料上接種成骨樣細(xì)胞MG63，另設(shè)空白對(duì)照組。甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測(cè)MG63細(xì)胞的增殖曲線，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)，SEM下觀察細(xì)胞在生物膜表面的增殖和黏附情況。結(jié)果 Ag-nHA-nTiO2/PA66膜正面疏松多孔，反面光滑致密。e-PTFE膜正反面結(jié)構(gòu)相同，由成行排列的長(zhǎng)橢圓形裂隙組成。與空白對(duì)照組相比，MTT檢測(cè)顯示，兩種膜對(duì)MG63細(xì)胞增殖活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；ALP活性間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。SEM下觀察細(xì)胞在兩種膜上生長(zhǎng)良好，在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜上細(xì)胞伸展更充分。

結(jié)論 Ag-nHA-nTiO2/PA66膜對(duì)MG63細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。與e-PTFE相比，其具有更優(yōu)良的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能，適于用作引導(dǎo)骨再生膜材料。

[關(guān)鍵詞] 引導(dǎo)骨再生； 羥磷灰石； 銀； 成骨樣細(xì)胞MG63

[中圖分類號(hào)] R 783.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.004

引導(dǎo)骨再生（guided bone regeneration，GBR）生物膜技術(shù)在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。載銀納米羥磷灰石/二氧化鈦/聚酰胺66（Ag-nHA-nTiO2/

PA66）納米抗菌復(fù)合膜是將無(wú)機(jī)納米復(fù)合抗菌材料

載銀納米羥磷灰石/納米二氧化鈦（Ag-nHA-nTiO2）和聚酰胺66（PA66）復(fù)合，采用“常壓共溶法”制備而

成的。在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜中的nTiO2和Ag+含量分別為0.48%和2.35%。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其對(duì)口腔常見(jiàn)細(xì)菌具有良好的抗菌性[1]。但是，對(duì)于該膜的結(jié)構(gòu)及生物相容性尚缺乏研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以膨體聚四氟乙烯（e-polytetra fluoroethylene，e-PTFE）膜為對(duì)照，通過(guò)光鏡和掃描電鏡（scanning electron mi-

croscope，SEM）對(duì)比觀察Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌

膜的結(jié)構(gòu)，并在兩種膜上接種成骨樣細(xì)胞株MG63，觀察MG63在膜上的生物學(xué)活動(dòng)變化，探討Ag-nHA-nTiO2/PA66膜作為GBR膜的生物相容性。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

e-PTFE膜（上海塑料研究所第一研究室），Ag-

nHA-nTiO2/PA66膜（四川大學(xué)納米生物材料中心），

SEM（JSM-5900，JEOL公司，日本），IX70倒置相差顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）等。

1.2 膜材料結(jié)構(gòu)觀察

將Ag-nHA-nTiO2/PA66膜和e-PTFE膜剪裁成

1 cm×1 cm方片，制作石蠟切片，厚5 μm，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，倒置顯微鏡觀

察膜橫截面的結(jié)構(gòu)。取兩種膜材料裁成同樣大小，真空干燥，噴金，采用SEM觀察膜的表面情況。

1.3 膜上成骨樣細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將e-PTFE膜和Ag-nHA-nTiO2/PA66膜剪裁成直徑為14 mm的圓片各12張，消毒后PBS液清洗3次，置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，另設(shè)空白對(duì)照組。按照細(xì)胞密度為每孔3×104個(gè)進(jìn)行接種，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下進(jìn)行孵育（37 ℃，95%空氣，5%CO2），分別于1、3、5、7 d各取出3孔，用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetra-

zolium，MTT）法，在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的光密度（optical density，OD）值，每組每次取得3孔的數(shù)

值，計(jì)算各組平均值，采用雙因素方差法分析結(jié)果。

1.4 細(xì)胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活

性測(cè)定

將e-PTFE膜和Ag-nHA-nTiO2/PA66膜剪裁成直徑為34 mm的圓片各12張，消毒后PBS液清洗3次，置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，另設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)板內(nèi)按照細(xì)胞密度為每孔6×105個(gè)接種MG63，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境（37 ℃，95%空氣，5%CO2）下進(jìn)行培養(yǎng)，分別于1、3、5、7 d各取出3孔，收集細(xì)胞，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔OD值，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ALP活力。

1.5 細(xì)胞黏附和增殖情況

細(xì)胞培養(yǎng)同1.4。分別于1、5 d取出膜片各3個(gè)，3%戊二醛固定，梯度脫水，醋酸異戊酯浸泡20 min。臨界點(diǎn)干燥，噴金，SEM下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 膜材料結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

2.1.1 倒置顯微鏡下觀察結(jié)果 HE染色后e-PTFE膜的橫截面結(jié)構(gòu)比較均勻一致，正、反面都可見(jiàn)較長(zhǎng)的裂隙，約30～50 μm，裂隙之間相互交通。正、反面都比較平滑，孔隙大小約為15 μm（圖1左）。Ag-

nHA-nTiO2/PA66膜的橫截面可見(jiàn)大小不等、形狀各異的孔隙相互連通。正面結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大小約50～300 μm，從正面到反面的橫截面中可見(jiàn)到300 μm的大孔隙；反面約有50 μm的孔隙，十分致密（圖1右）。

2.1.2 SEM下觀察結(jié)果 e-PTFE膜可見(jiàn)成行排列、直徑不一的長(zhǎng)橢圓形裂隙，長(zhǎng)約5～20 μm，寬約3 μm，正、反面結(jié)構(gòu)基本一致（圖2）。Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜的正面疏松多孔，由大小不等的孔隙構(gòu)成，孔隙大小從幾微米到上百微米不等，孔隙的形狀各異，大孔隙之間相互通連，其中又有許多小的孔隙，有的孔隙中可見(jiàn)到一些顆粒狀的沉積物。反面比較平滑，孔隙的大小為1～10 μm，孔隙形狀多為圓形，孔隙之間未見(jiàn)交通（圖3）。

Fig 3 Surfaces of Ag-nHA-nTiO2/PA66 membrane SEM × 2 000

2.2 MG63細(xì)胞在兩種膜上的生長(zhǎng)情況

2.2.1 細(xì)胞增殖曲線的測(cè)定 分別在1、3、5、7 d測(cè)定兩種膜組和空白對(duì)照組的OD值，計(jì)算其相對(duì)時(shí)間點(diǎn)上的均值，繪制細(xì)胞增殖曲線（圖4）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分

析表明，3組細(xì)胞增殖量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），每組在時(shí)間點(diǎn)上的數(shù)據(jù)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），第1天到第7天逐步增高。

2.2.2 細(xì)胞ALP活性的測(cè)定 將收集的細(xì)胞反復(fù)凍融2次后，測(cè)定3組不同時(shí)段的ALP活性。隨著時(shí)間的增加，每組ALP活性均有所增加。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，每組細(xì)胞ALP活性第3天與第5天間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而3組間的ALP活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖5）。

2.3 細(xì)胞在膜上黏附和增殖的SEM觀察

2.3.1 細(xì)胞在e-PTFE膜上的黏附和增殖情況 膜上接種MG63細(xì)胞第1天，SEM下觀察到細(xì)胞零星的分散在膜上，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，偽足伸展長(zhǎng)短不一，胞核清楚，胞漿豐富（圖6左）。膜上接種MG63細(xì)胞第5天，SEM下觀察到細(xì)胞呈片狀分布在膜上不同的區(qū)域，多個(gè)細(xì)胞相互交聯(lián)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞偽足伸展不充分，未見(jiàn)細(xì)胞伸入到空隙中（圖6右）。

2.3.2 細(xì)胞在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜上的黏附和增殖情況 膜上接種MG63細(xì)胞第1天，SEM下觀察到細(xì)胞黏附在孔隙的邊緣和中間，形態(tài)有長(zhǎng)梭形，偽足伸展良好，細(xì)胞形態(tài)多樣，細(xì)胞伸出的偽足黏附在孔隙的表面和孔隙中（圖7左）。

接種MG63細(xì)胞第5天，SEM下觀察到細(xì)胞已經(jīng)長(zhǎng)在膜表面，呈片層狀，細(xì)胞有長(zhǎng)條形、梭形，形態(tài)各異。有的細(xì)胞兩端跨越孔隙，有的黏附在孔隙的邊緣，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞相互交通（圖7右）。

3 討論

1982年Nyman等[2]在牙周病的治療中提出引導(dǎo)性組織再生（guided tissue regeneration，GTR）。其基

本原理是：不同組織細(xì)胞向創(chuàng)口內(nèi)生長(zhǎng)或遷移速度不同，局部植入人工生物引導(dǎo)膜，利用膜屏障建立一個(gè)能使生物再生功能得到最大程度發(fā)揮的有利環(huán)境[2]。骨組織是以再生方式完成損傷修復(fù)的少數(shù)組織

之一，GTR概念同樣適用于骨再生過(guò)程即GBR。目前，GBR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于口腔種植修復(fù)領(lǐng)域。

在GBR的操作以及后期使用中經(jīng)常出現(xiàn)膜暴露、創(chuàng)口感染等問(wèn)題，嚴(yán)重影響GBR成功率[3]，開(kāi)發(fā)具備

抗菌性能的GBR膜尤為重要。但是，很多材料在抗菌的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成抑制甚至造成正常細(xì)胞死亡。因此，在探討膜的抗菌性能時(shí)，更為重要的是確認(rèn)膜的生物相容性。本實(shí)驗(yàn)中使用的抗菌Ag+即是廣泛被用作抗菌作用的有效成分，筆者的前期研究也證實(shí)Ag-nHA-nTiO2/PA66具有良好的抗菌性能，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率分別為50.10%和56.31%，而對(duì)牙齦卟啉單胞菌、變異鏈球菌和具核梭桿菌的抗菌率分別為91.84%、90.49%和90.64%[1]。這同其他研究結(jié)果類似，即Ag+具有一定的抗菌性能[4]。但是既往研究同時(shí)表明：當(dāng)Ag+濃度較高時(shí)對(duì)真核細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性，從而抑制細(xì)胞活力[5]。Chung等[6]對(duì)Ag+的生物相容性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Ag+對(duì)細(xì)胞的活力有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)抗菌復(fù)合膜中起抗菌作用的主要成分也是Ag+。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)新開(kāi)發(fā)的Ag-nHA-nTiO2/PA66復(fù)合膜進(jìn)行了生物相容性方面的研究。結(jié)果顯示，對(duì)比e-PTFE膜，載Ag+復(fù)合膜上，MG63細(xì)胞伸展良好，細(xì)胞偽足深入空隙且互有交通。細(xì)胞增殖曲線顯示細(xì)胞增殖活性不受抑制。ALP檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞功能良好，成骨能力未受Ag+的影響。由此可見(jiàn)，抗菌復(fù)合膜Ag+濃度適宜，不會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。說(shuō)明Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜生物相容性良好。

體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)法簡(jiǎn)便、敏感、重復(fù)性好，已經(jīng)成為評(píng)價(jià)生物材料相容性的重要手段[7]。成骨細(xì)

胞是一種特殊的成纖維細(xì)胞，在骨改建中具有關(guān)鍵性作用，成為骨代謝研究中的重要部分。采用體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞可評(píng)價(jià)材料的生物相容性，并且準(zhǔn)確的反映材料對(duì)機(jī)體的影響。本研究選用的成骨樣細(xì)胞株MG63具有多次傳代后仍能保持穩(wěn)定細(xì)胞表型的特性；同時(shí)成骨樣細(xì)胞株與普通成骨細(xì)胞表型接近，在很多成骨相關(guān)的研究中都采納成骨樣細(xì)胞株作為研究對(duì)象[8]。本實(shí)驗(yàn)選擇成骨樣細(xì)胞株MG63

作為研究對(duì)象，由SEM及ALP表達(dá)情況來(lái)看，細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)及功能表達(dá)良好，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中MG63性狀和表達(dá)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

引導(dǎo)膜的結(jié)構(gòu)及其生物相容性在GBR生物膜技術(shù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該膜既要允許營(yíng)養(yǎng)通過(guò)，又要求能隔離周圍結(jié)締組織細(xì)胞長(zhǎng)入。既往研究表明：理想的膜支架材料應(yīng)有較高的孔隙率和孔隙貫通率，以及適于骨組織生長(zhǎng)的力學(xué)支撐[9]。當(dāng)孔徑在150 μm以上，則是骨組織長(zhǎng)入的理想場(chǎng)所。本實(shí)驗(yàn)中e-PTFE膜結(jié)構(gòu)均一，最大孔徑在20 μm以內(nèi)；Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜則存在正反面的結(jié)構(gòu)，正面孔徑可達(dá)上百微米，而反面孔徑最大不超過(guò)10 μm。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)：e-PTFE膜上細(xì)胞可黏附但無(wú)深入生長(zhǎng)，而Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜上MG63細(xì)胞生長(zhǎng)良好，且細(xì)胞偽足深入孔內(nèi)。由此說(shuō)明，相比較e-PTFE膜，Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜更具有優(yōu)勢(shì)，其雙層結(jié)構(gòu)在為成骨細(xì)胞提供支架的同時(shí)，致密一面可以阻止軟組織長(zhǎng)入，而疏松的一面則有利于新骨組織的生成。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察Ag-nHA-nTiO2/PA66膜的結(jié)構(gòu)以及MG63細(xì)胞在其上的生長(zhǎng)、表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Ag-nHA-nTiO2/PA66膜對(duì)MG63細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，MG63細(xì)胞在其組織面上黏附效果好，能夠充分生長(zhǎng)和增殖。綜上所述，Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌復(fù)合膜具有優(yōu)良的結(jié)構(gòu)及生物相容性，具有作為GBR膜的可行性。當(dāng)然Ag-nHA-nTiO2/PA66膜是否能成為優(yōu)良的GBR膜，還需進(jìn)一步深入研究。

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（本文采編 石冰）