鈣周期素結(jié)合蛋白的細(xì)胞周期依賴性轉(zhuǎn)位現(xiàn)象

陳 陽(yáng), 白 薇, 劉崇霞, 楊 芳, 路國(guó)華, 王曉明, 李 源, 寧曉暄

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科, 西安 710032）

鈣周期素結(jié)合蛋白（calcyclin-binding protein，CacyBP/SIP）最初是由Filipek等人在小鼠艾氏腹水細(xì)胞瘤中作為S100A6的靶蛋白而發(fā)現(xiàn)[1]，而后通過序列分析發(fā)現(xiàn)其與siah-1結(jié)合，稱作SIP（siah-1 interacting protein），二者具有93%同源性，所以SIP即為人CacyBP/SIP[2]。CacyBP/SIP可與S100A6、Siah-1、Skp1、微管蛋白、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）等分子結(jié)合，并且參與了組織細(xì)胞分化和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元細(xì)胞中CacyBP/SIP還存在細(xì)胞內(nèi)鈣濃度依賴的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。本研究將在胃癌細(xì)胞中觀察CacyBP/SIP的亞細(xì)胞定位與細(xì)胞周期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞SGC-7901（為第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存）。

1.2 試劑和儀器

RPMI1640（美國(guó)賽默飛世爾公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；FITC標(biāo)記抗鼠（北京中杉金橋公司）；鼠抗CacyBP（美國(guó)Santa Cruz公司）；Lamin-A多克隆抗體（美國(guó)ProteinTech公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；同步化試劑胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，簡(jiǎn)稱胸苷，美國(guó)sigma公司）；核蛋白提取試劑盒（碧云天公司）。流式細(xì)胞儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）；熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；孵箱（美國(guó)賽默飛世爾公司）。

1.3 細(xì)胞同步化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，以2×108細(xì)胞/L的密度鋪于6孔板中，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞50%融合時(shí)，在完全培養(yǎng)基中加入同步化試劑胸苷，使其終濃度為2mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)16h；棄去培養(yǎng)液，更換無藥新鮮培養(yǎng)基，5%CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)8h；再加入終濃度為2mmol/L的胸苷，繼續(xù)培養(yǎng)16h；棄培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞2次，更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行釋放，分別于0，4，8，12，16h用0.25%胰酶消化并獲取細(xì)胞；PBS洗滌細(xì)胞2次；加入無水乙醇固定，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測(cè)。

1.4 免疫熒光染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并調(diào)整密度至2～3×107細(xì)胞/L，接種于無菌蓋玻片上，37℃、5%CO2培養(yǎng)24～36h后進(jìn)行細(xì)胞同步化，同時(shí)設(shè)只加入等藥體積無血清培養(yǎng)基的無藥對(duì)照組，在同步化后不同時(shí)間段，取出蓋玻片，PBS沖洗3次，無水乙醇固定；PBS沖洗細(xì)胞爬片3次，5min/次，0.3%Trtion-X-100通透細(xì)胞20min，PBS沖洗細(xì)胞爬片3次，5min/次，山羊血清室溫封閉1h；在細(xì)胞爬片上加入抗CacyBP/SIP抗體，放入濕盒中4℃過夜，第2日室溫復(fù)溫1h，PBS沖洗細(xì)胞爬片3次，5min/次；加FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，濕盒中室溫封閉1.5h；PBS沖洗3次，5min/次，DAPI染核3min；PBS沖洗3次，5min/次，防熒光淬滅劑封片，上機(jī)觀察。

1.5 核蛋白提取

參考碧云天公司細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書。

1.6 Western印記法

配置10%的下層膠和5%上層膠，根據(jù)不同蛋白濃度調(diào)整上樣量，進(jìn)行聚丙烯氨凝膠電泳。凝膠于電泳緩沖液中25mA，40min進(jìn)行電泳，用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。用麗春紅染液對(duì)NC膜染色，標(biāo)記蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)各條帶位置，按照目的蛋白大小剪膜。將剪好的NC膜放入用TBST配置的5%脫脂牛奶中室溫封閉1h。一抗為鼠抗CacyBP/SIP抗體，1∶200稀釋于5%脫脂牛奶中，4℃孵育過夜。1倍TBST搖洗NC膜3次，5min/次。HRP標(biāo)記的二抗1∶1000稀釋于5%脫脂牛奶中，室溫孵育1h。1倍TBST搖洗NC膜3次，5min/次，最后ECL顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞周期同步化

經(jīng)過雙胸苷阻滯法進(jìn)行細(xì)胞周期同步化使其阻滯在G1期，而后進(jìn)行釋放，在不同時(shí)間段提取細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在釋放0，4及16h，細(xì)胞主要處于G1/S期，8，12h時(shí)則主要處于G2期（圖1）。

2.2 免疫熒光染色

經(jīng)過雙胸苷阻滯法對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901進(jìn)行處理，使其阻滯在G1期，而后釋放，分別在釋放0，4，8，12，16h時(shí)，利用免疫熒光染色后，熒光顯微鏡觀察CacyBP/SIP分子的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組CacyBP/SIP在細(xì)胞周期同步化0，4，16h時(shí)（以G1/S期細(xì)胞為主）主要分布在胞漿中（圖2 A、B和E），而在8h定位于核周，12h時(shí)則進(jìn)入核內(nèi)（圖2 C和D，以G2期細(xì)胞為主），提示CacyBP/SIP存在細(xì)胞周期依賴的定位變化。而對(duì)照組在相同時(shí)間段并無入核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象（圖2C'和D'）。

2.3 Western印記法

將胃癌細(xì)胞SGC7901利用胸苷進(jìn)行同步化后，分別在0，4，8，12，16h提取總蛋白與核蛋白，Western印記法檢測(cè)CacyBP/SIP的表達(dá)水平，在細(xì)胞周期的不同時(shí)期，CacyBP/SIP的總蛋白并無明顯變化（P＞0.05；圖3）。核蛋白表達(dá)水平在8，12h有所增高，與0，4，16h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖4）。Western印記法結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，CacyBP/SIP在胃癌細(xì)胞的G2期時(shí)發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。

圖1 細(xì)胞周期同步化效果Figure 1 Effect of cell cycle synchronization

3 討 論

Filipek等在1996年從小鼠艾氏腹水細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新分子，并命名為CacyBP/SIP，其分子量大小約30ku，編碼229個(gè)氨基酸。CacyBP/SIP在脾臟及腦中高表達(dá)，肝、胃及心臟中呈中等程度表達(dá)，淋巴結(jié)、結(jié)腸及腎臟中則呈低水平表達(dá)[1,3]。CacyBP/SIP不但可以配體形式與S100A6結(jié)合，而且還與S100家族中其他一些蛋白結(jié)合，例如S100A1、S100A2、S100B、S100P[4]。

在對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤NB2a及人神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY5Y研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí)，CacyBP/SIP分子可以從胞漿向胞核及核周轉(zhuǎn)位。進(jìn)一步研究證實(shí)，CacyBP/SIP的這種鈣依賴核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象是由于絲氨酸磷酸化所致[5]。目前已知，CacyBP/SIP與細(xì)胞的分化、增殖等有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP與ERK1/2結(jié)合可以使得Elk-1的轉(zhuǎn)錄活性降低，影響細(xì)胞的分化，并且可與微管蛋白結(jié)合并參與細(xì)胞的骨架重構(gòu)[6]。在神經(jīng)元衰老過程中，CacyBP/SIP還發(fā)生了定位變化，這可能與其自身磷酸化或與磷酸化微管蛋白的結(jié)合有一定關(guān)系[7]。p27蛋白不僅參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，還影響細(xì)胞遷移，而Nagano等[8]發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP可以通過降解成纖維細(xì)胞中p27蛋白，從而降低細(xì)胞的遷移能力。另有研究表明，抑制子宮基質(zhì)細(xì)胞中CacyBP/SIP的表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，從而使得細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯提高[9]。而CacyBP/SIP基因缺失的淋巴細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)pre-TCR檢測(cè)點(diǎn)受損，不能進(jìn)行TCRβ基因重排，而且凋亡增加，進(jìn)而導(dǎo)致胸腺細(xì)胞數(shù)減少[10]。

CacyBP/SIP與Siah-1、Skp1、Ebi結(jié)合形成泛素連接酶復(fù)合物，參與了非磷酸化β-catenin的降解。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中有重要作用[11]。因此，我們首先研究了CacyBP/SIP在胃癌細(xì)胞發(fā)生中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP上調(diào)可以抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和成瘤性，降低胃癌細(xì)胞的侵襲力，可誘發(fā)胃癌細(xì)胞凋亡[12]。我們的進(jìn)一步研究顯示，S100A6與CacyBP/SIP結(jié)合可以負(fù)向調(diào)控CacyBP/SIP對(duì)β-catenin的降解作用[13]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在腎癌細(xì)胞及腎癌組織中的表達(dá)顯著低于正常的腎小管上皮細(xì)胞和癌旁組織。上調(diào)腎癌細(xì)胞中CacyBP/SIP可以通過促進(jìn)β-catenin的降解進(jìn)而影響cyclin D1的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腎癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯[14]。

由于泛素化降解途徑在細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，所以我們推測(cè)CacyBP/SIP可能從不同途徑參與細(xì)胞周期的調(diào)控。為此我們首先研究了CacyBP/SIP在細(xì)胞周期中的定位。我們用雙thymidine阻滯法使胃癌細(xì)胞SGC7901有效阻滯于G1/S期，并在8和12h主要進(jìn)入G2/M期。免疫熒光顯示，CacyBP/SIP在G1/S期主要定位于胞漿，G2期發(fā)生轉(zhuǎn)位并定位于核周及核內(nèi)。而對(duì)照組在相同時(shí)間段并無CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，這說明觀察的結(jié)果與雙thymidine阻滯法的處理有關(guān)。通過對(duì)細(xì)胞核蛋白的檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)CacyBP/SIP在G2期進(jìn)入胞核，表明CacyBP/SIP存在細(xì)胞周期依賴的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。另外，在各細(xì)胞周期中CacyBP/SIP總蛋白表達(dá)無明顯變化，提示CacyBP/SIP并未有細(xì)胞周期相關(guān)的表達(dá)改變，只是定位變化。目前CacyBP/SIP在細(xì)胞周期的定位及其作用還未見文獻(xiàn)報(bào)道，其調(diào)控機(jī)制還不清，我們推測(cè)CacyBP/SIP可能通過以下機(jī)制調(diào)控細(xì)胞周期G2/M期：（1）泛素連接酶活性的變化：CacyBP/SIP向核周及胞核轉(zhuǎn)位后，發(fā)生磷酸化，同時(shí)泛素連接酶的活性增強(qiáng)，從而降解細(xì)胞周期相關(guān)分子；（2）通過定位變化使特定部位的蛋白降解：CacyBP/SIP向核周及胞核轉(zhuǎn)位后，可能引起核周和胞核中一些蛋白的降解；（3）定位變化可能使與其結(jié)合的某些蛋白進(jìn)入特定部位發(fā)揮作用：CacyBP/SIP可以與微管蛋白發(fā)生結(jié)合，將其攜帶至細(xì)胞核，使微管蛋白在胞核聚合成微管而發(fā)生作用。上述的推測(cè)還需進(jìn)一步證實(shí)。另外CacyBP/SIP是否受到細(xì)胞周期相關(guān)激酶的調(diào)控而發(fā)生轉(zhuǎn)位也需要深入研究。CacyBP/SIP是細(xì)胞周期調(diào)控分子，可能通過蛋白降解或其他途徑影響細(xì)胞分裂周期，特別是G2/M期，從而參與細(xì)胞周期的調(diào)控，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，CacyBP/SIP可能是一種細(xì)胞周期調(diào)控分子，可能通過多種途徑影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而參與了細(xì)胞的多種病理生理活動(dòng),但其更多的生物學(xué)功能仍需要更進(jìn)一步研究。

圖2 細(xì)胞周期對(duì)CacyBP/SIP細(xì)胞內(nèi)定位的影響Figure 2 Influence of cell cycle on intra-cellular location of CacyBP/SIP (×40)

圖3 細(xì)胞周期對(duì)CacyBP/SIP總蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Influence of cell cycle on expression of total CacyBP/SIP protein

圖4 細(xì)胞周期對(duì)CacyBP/SIP核蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Influence of cell cycle on expression of nuclear CacyBP/SIP protein

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