陳 陽(yáng), 白 薇, 劉崇霞, 楊 芳, 路國(guó)華, 王曉明, 李 源, 寧曉暄
(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科, 西安 710032)
鈣周期素結(jié)合蛋白(calcyclin-binding protein,CacyBP/SIP)最初是由Filipek等人在小鼠艾氏腹水細(xì)胞瘤中作為S100A6的靶蛋白而發(fā)現(xiàn)[1],而后通過序列分析發(fā)現(xiàn)其與siah-1結(jié)合,稱作SIP(siah-1 interacting protein),二者具有93%同源性,所以SIP即為人CacyBP/SIP[2]。CacyBP/SIP可與S100A6、Siah-1、Skp1、微管蛋白、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)等分子結(jié)合,并且參與了組織細(xì)胞分化和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元細(xì)胞中CacyBP/SIP還存在細(xì)胞內(nèi)鈣濃度依賴的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。本研究將在胃癌細(xì)胞中觀察CacyBP/SIP的亞細(xì)胞定位與細(xì)胞周期的關(guān)系。
人胃癌細(xì)胞SGC-7901(為第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存)。
RPMI1640(美國(guó)賽默飛世爾公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);FITC標(biāo)記抗鼠(北京中杉金橋公司);鼠抗CacyBP(美國(guó)Santa Cruz公司);Lamin-A多克隆抗體(美國(guó)ProteinTech公司);BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);同步化試劑胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine,簡(jiǎn)稱胸苷,美國(guó)sigma公司);核蛋白提取試劑盒(碧云天公司)。流式細(xì)胞儀(美國(guó)賽默飛世爾公司);熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);孵箱(美國(guó)賽默飛世爾公司)。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化,以2×108細(xì)胞/L的密度鋪于6孔板中,37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng);待細(xì)胞50%融合時(shí),在完全培養(yǎng)基中加入同步化試劑胸苷,使其終濃度為2mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)16h;棄去培養(yǎng)液,更換無藥新鮮培養(yǎng)基,5%CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)8h;再加入終濃度為2mmol/L的胸苷,繼續(xù)培養(yǎng)16h;棄培養(yǎng)基,洗滌細(xì)胞2次,更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行釋放,分別于0,4,8,12,16h用0.25%胰酶消化并獲取細(xì)胞;PBS洗滌細(xì)胞2次;加入無水乙醇固定,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測(cè)。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并調(diào)整密度至2~3×107細(xì)胞/L,接種于無菌蓋玻片上,37℃、5%CO2培養(yǎng)24~36h后進(jìn)行細(xì)胞同步化,同時(shí)設(shè)只加入等藥體積無血清培養(yǎng)基的無藥對(duì)照組,在同步化后不同時(shí)間段,取出蓋玻片,PBS沖洗3次,無水乙醇固定;PBS沖洗細(xì)胞爬片3次,5min/次,0.3%Trtion-X-100通透細(xì)胞20min,PBS沖洗細(xì)胞爬片3次,5min/次,山羊血清室溫封閉1h;在細(xì)胞爬片上加入抗CacyBP/SIP抗體,放入濕盒中4℃過夜,第2日室溫復(fù)溫1h,PBS沖洗細(xì)胞爬片3次,5min/次;加FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗,濕盒中室溫封閉1.5h;PBS沖洗3次,5min/次,DAPI染核3min;PBS沖洗3次,5min/次,防熒光淬滅劑封片,上機(jī)觀察。
參考碧云天公司細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書。
配置10%的下層膠和5%上層膠,根據(jù)不同蛋白濃度調(diào)整上樣量,進(jìn)行聚丙烯氨凝膠電泳。凝膠于電泳緩沖液中25mA,40min進(jìn)行電泳,用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。用麗春紅染液對(duì)NC膜染色,標(biāo)記蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)各條帶位置,按照目的蛋白大小剪膜。將剪好的NC膜放入用TBST配置的5%脫脂牛奶中室溫封閉1h。一抗為鼠抗CacyBP/SIP抗體,1∶200稀釋于5%脫脂牛奶中,4℃孵育過夜。1倍TBST搖洗NC膜3次,5min/次。HRP標(biāo)記的二抗1∶1000稀釋于5%脫脂牛奶中,室溫孵育1h。1倍TBST搖洗NC膜3次,5min/次,最后ECL顯色。
采用SPSS16.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
經(jīng)過雙胸苷阻滯法進(jìn)行細(xì)胞周期同步化使其阻滯在G1期,而后進(jìn)行釋放,在不同時(shí)間段提取細(xì)胞,并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在釋放0,4及16h,細(xì)胞主要處于G1/S期,8,12h時(shí)則主要處于G2期(圖1)。
經(jīng)過雙胸苷阻滯法對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901進(jìn)行處理,使其阻滯在G1期,而后釋放,分別在釋放0,4,8,12,16h時(shí),利用免疫熒光染色后,熒光顯微鏡觀察CacyBP/SIP分子的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組CacyBP/SIP在細(xì)胞周期同步化0,4,16h時(shí)(以G1/S期細(xì)胞為主)主要分布在胞漿中(圖2 A、B和E),而在8h定位于核周,12h時(shí)則進(jìn)入核內(nèi)(圖2 C和D,以G2期細(xì)胞為主),提示CacyBP/SIP存在細(xì)胞周期依賴的定位變化。而對(duì)照組在相同時(shí)間段并無入核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象(圖2C'和D')。
將胃癌細(xì)胞SGC7901利用胸苷進(jìn)行同步化后,分別在0,4,8,12,16h提取總蛋白與核蛋白,Western印記法檢測(cè)CacyBP/SIP的表達(dá)水平,在細(xì)胞周期的不同時(shí)期,CacyBP/SIP的總蛋白并無明顯變化(P>0.05;圖3)。核蛋白表達(dá)水平在8,12h有所增高,與0,4,16h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖4)。Western印記法結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),CacyBP/SIP在胃癌細(xì)胞的G2期時(shí)發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。
圖1 細(xì)胞周期同步化效果Figure 1 Effect of cell cycle synchronization
Filipek等在1996年從小鼠艾氏腹水細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新分子,并命名為CacyBP/SIP,其分子量大小約30ku,編碼229個(gè)氨基酸。CacyBP/SIP在脾臟及腦中高表達(dá),肝、胃及心臟中呈中等程度表達(dá),淋巴結(jié)、結(jié)腸及腎臟中則呈低水平表達(dá)[1,3]。CacyBP/SIP不但可以配體形式與S100A6結(jié)合,而且還與S100家族中其他一些蛋白結(jié)合,例如S100A1、S100A2、S100B、S100P[4]。
在對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤NB2a及人神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY5Y研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí),CacyBP/SIP分子可以從胞漿向胞核及核周轉(zhuǎn)位。進(jìn)一步研究證實(shí),CacyBP/SIP的這種鈣依賴核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象是由于絲氨酸磷酸化所致[5]。目前已知,CacyBP/SIP與細(xì)胞的分化、增殖等有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn),CacyBP/SIP與ERK1/2結(jié)合可以使得Elk-1的轉(zhuǎn)錄活性降低,影響細(xì)胞的分化,并且可與微管蛋白結(jié)合并參與細(xì)胞的骨架重構(gòu)[6]。在神經(jīng)元衰老過程中,CacyBP/SIP還發(fā)生了定位變化,這可能與其自身磷酸化或與磷酸化微管蛋白的結(jié)合有一定關(guān)系[7]。p27蛋白不僅參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),還影響細(xì)胞遷移,而Nagano等[8]發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP可以通過降解成纖維細(xì)胞中p27蛋白,從而降低細(xì)胞的遷移能力。另有研究表明,抑制子宮基質(zhì)細(xì)胞中CacyBP/SIP的表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡,從而使得細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯提高[9]。而CacyBP/SIP基因缺失的淋巴細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)pre-TCR檢測(cè)點(diǎn)受損,不能進(jìn)行TCRβ基因重排,而且凋亡增加,進(jìn)而導(dǎo)致胸腺細(xì)胞數(shù)減少[10]。
CacyBP/SIP與Siah-1、Skp1、Ebi結(jié)合形成泛素連接酶復(fù)合物,參與了非磷酸化β-catenin的降解。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子,在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中有重要作用[11]。因此,我們首先研究了CacyBP/SIP在胃癌細(xì)胞發(fā)生中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CacyBP/SIP上調(diào)可以抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和成瘤性,降低胃癌細(xì)胞的侵襲力,可誘發(fā)胃癌細(xì)胞凋亡[12]。我們的進(jìn)一步研究顯示,S100A6與CacyBP/SIP結(jié)合可以負(fù)向調(diào)控CacyBP/SIP對(duì)β-catenin的降解作用[13]。此外,我們還發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在腎癌細(xì)胞及腎癌組織中的表達(dá)顯著低于正常的腎小管上皮細(xì)胞和癌旁組織。上調(diào)腎癌細(xì)胞中CacyBP/SIP可以通過促進(jìn)β-catenin的降解進(jìn)而影響cyclin D1的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致腎癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯[14]。
由于泛素化降解途徑在細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用,所以我們推測(cè)CacyBP/SIP可能從不同途徑參與細(xì)胞周期的調(diào)控。為此我們首先研究了CacyBP/SIP在細(xì)胞周期中的定位。我們用雙thymidine阻滯法使胃癌細(xì)胞SGC7901有效阻滯于G1/S期,并在8和12h主要進(jìn)入G2/M期。免疫熒光顯示,CacyBP/SIP在G1/S期主要定位于胞漿,G2期發(fā)生轉(zhuǎn)位并定位于核周及核內(nèi)。而對(duì)照組在相同時(shí)間段并無CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,這說明觀察的結(jié)果與雙thymidine阻滯法的處理有關(guān)。通過對(duì)細(xì)胞核蛋白的檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)CacyBP/SIP在G2期進(jìn)入胞核,表明CacyBP/SIP存在細(xì)胞周期依賴的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。另外,在各細(xì)胞周期中CacyBP/SIP總蛋白表達(dá)無明顯變化,提示CacyBP/SIP并未有細(xì)胞周期相關(guān)的表達(dá)改變,只是定位變化。目前CacyBP/SIP在細(xì)胞周期的定位及其作用還未見文獻(xiàn)報(bào)道,其調(diào)控機(jī)制還不清,我們推測(cè)CacyBP/SIP可能通過以下機(jī)制調(diào)控細(xì)胞周期G2/M期:(1)泛素連接酶活性的變化:CacyBP/SIP向核周及胞核轉(zhuǎn)位后,發(fā)生磷酸化,同時(shí)泛素連接酶的活性增強(qiáng),從而降解細(xì)胞周期相關(guān)分子;(2)通過定位變化使特定部位的蛋白降解:CacyBP/SIP向核周及胞核轉(zhuǎn)位后,可能引起核周和胞核中一些蛋白的降解;(3)定位變化可能使與其結(jié)合的某些蛋白進(jìn)入特定部位發(fā)揮作用:CacyBP/SIP可以與微管蛋白發(fā)生結(jié)合,將其攜帶至細(xì)胞核,使微管蛋白在胞核聚合成微管而發(fā)生作用。上述的推測(cè)還需進(jìn)一步證實(shí)。另外CacyBP/SIP是否受到細(xì)胞周期相關(guān)激酶的調(diào)控而發(fā)生轉(zhuǎn)位也需要深入研究。CacyBP/SIP是細(xì)胞周期調(diào)控分子,可能通過蛋白降解或其他途徑影響細(xì)胞分裂周期,特別是G2/M期,從而參與細(xì)胞周期的調(diào)控,進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的增殖。
綜上所述,CacyBP/SIP可能是一種細(xì)胞周期調(diào)控分子,可能通過多種途徑影響細(xì)胞周期進(jìn)程,進(jìn)而參與了細(xì)胞的多種病理生理活動(dòng),但其更多的生物學(xué)功能仍需要更進(jìn)一步研究。
圖2 細(xì)胞周期對(duì)CacyBP/SIP細(xì)胞內(nèi)定位的影響Figure 2 Influence of cell cycle on intra-cellular location of CacyBP/SIP (×40)
圖3 細(xì)胞周期對(duì)CacyBP/SIP總蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Influence of cell cycle on expression of total CacyBP/SIP protein
圖4 細(xì)胞周期對(duì)CacyBP/SIP核蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Influence of cell cycle on expression of nuclear CacyBP/SIP protein
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