崔淑芹

山東德州學(xué)院醫(yī)學(xué)系，德州 253023

長期大量飲酒可導(dǎo)致慢性乙醇中毒，產(chǎn)生認(rèn)知障礙、行為異常、精神異常和乙醇中毒性腦病等［1－3］。認(rèn)知障礙是指因腦部功能受損而產(chǎn)生的學(xué)習(xí)記憶以及思維判斷功能的異常。學(xué)習(xí)記憶是人和動(dòng)物賴以生存的重要腦功能之一，學(xué)習(xí)記憶障礙是長期飲酒對(duì)人們生活健康影響最普遍和最嚴(yán)重的問題之一，目前認(rèn)為最可能參與記憶痕跡形成的結(jié)構(gòu)是小腦、海馬、杏仁體和大腦皮層，其中海馬在信息的獲得和儲(chǔ)存方面起著重要作用。研究表明，阿片肽、乙酰膽堿、γ－氨基丁酸（GABA）等多種中樞神經(jīng)遞質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過建立慢性乙醇中毒大鼠模型，采用放射免疫分析法系統(tǒng)檢測慢性乙醇中毒及葛根素干預(yù)后大鼠皮層、海馬、小腦和紋狀體內(nèi)阿片肽含量的變化，探討葛根素對(duì)慢性乙醇中毒大鼠多腦區(qū)內(nèi)源性阿片肽含量的調(diào)控作用，為臨床治療慢性乙醇中毒和開發(fā)中藥葛根作為解酒藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠24只（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司），56%（V／V）白酒（北京懷柔紅星股份有限公司生產(chǎn)），2%的注射用葛根素（山東瑞陽制藥有限公司），β-內(nèi)啡肽（β-EP）、亮腦啡肽（L-EK）和強(qiáng)啡肽 A（DnyA）放免試劑盒（第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法

24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、慢性乙醇中毒組（乙醇組）和葛根素組，每組8只，自由進(jìn)食。參照文獻(xiàn)［4］制備動(dòng)物模型。慢性乙醇中毒組：用56%（V／V）白酒灌胃，第1周每天6g／kg，1次灌胃，第2、3周每天12g／kg，1次灌胃，第4周每天15g／kg，分2次灌胃。葛根素組：白酒灌胃＋葛根素腹腔注射，白酒劑量與慢性乙醇中毒組相同，葛根素劑量第1周為100mg／kg，第2、3周為150mg／kg，第4周為200mg／kg。對(duì)照組給予等容量生理鹽水灌胃及腹腔注射。

1.3 標(biāo)本檢測

于實(shí)驗(yàn)第4周末次給藥24h后，斷頭處死大鼠，立即取下鼠腦，在沸生理鹽水中煮5min，分離皮層、小腦、海馬和紋狀體，準(zhǔn)確稱重，分別置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入1mol／L的 HAc 1mL，充分勻漿后轉(zhuǎn)入到塑料試管中，室溫放置100min。4℃，4 000 r／min離心20min，取上清加入1mol／L NaOH 1 mL，中和酸，按照試劑盒說明檢測β-EP、DnyA和L-EK的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件 GraphPad Prism 4.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，β-EP、DnyA和L-EK的檢測結(jié)果用±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮層、小腦、海馬、紋狀體β-EP的測定

從圖1可以看出，慢性乙醇中毒組各腦區(qū)β-EP含量均低于對(duì)照組（均P＜0.01），葛根素組各腦區(qū)β-EP較慢性乙醇中毒組升高（P＜0.05，P＜0.01）或有升高趨勢(shì)（圖1A），提示葛根素對(duì)慢性乙醇中毒大鼠腦內(nèi)β-EP有調(diào)節(jié)作用。

2.2 皮層、小腦、海馬、紋狀體L-EK的測定

從圖2可以看出，慢性乙醇中毒組各腦區(qū)LEK含量均高于對(duì)照組（均P＜0.01），葛根素組各腦區(qū)L-EK較乙醇中毒組降低（均P＜0.01），尤其是紋狀體，該指標(biāo)已接近對(duì)照組。提示，葛根素對(duì)慢性乙醇中毒大鼠腦內(nèi)L-EK有抑制作用。

圖1 皮層、小腦、海馬和紋狀體β-EP含量Fig.1 Contents ofβ-EP in the cortex，cerebellum，hippocampus and striatum

圖2 皮層、小腦、海馬和紋狀體L-EK的含量Fig.2 Contents of L-EK in the cortex，cerebellum，hippocampus and striatum

2.3 皮層、小腦、海馬、紋狀體DnyA的測定

從圖3可以看出，慢性乙醇中毒組各腦區(qū)DnyA含量均顯著高于對(duì)照組（均P＜0.01），葛根素組各腦區(qū)DnyA含量均較慢性乙醇中毒組明顯降低（均P＜0.01），在紋狀體，該指標(biāo)接近正常對(duì)照組。提示，葛根素對(duì)慢性乙醇中毒大鼠腦內(nèi)DnyA有抑制作用。

圖3 皮層、小腦、海馬和紋狀體DnyA的含量Fig.3 Contents of DnyA in the cortex，cerebellum，hippocampus and striatum

2.4 葛根素對(duì)慢性乙醇中毒大鼠各腦區(qū)阿片肽調(diào)節(jié)幅度的比較

通過阿片肽相對(duì)值反映葛根素對(duì)慢性乙醇中毒大鼠各腦區(qū)阿片肽的調(diào)節(jié)幅度，阿片肽相對(duì)值（%）＝（葛根素組阿片肽含量－慢性乙醇中毒組阿片肽含量）／慢性乙醇中毒組阿片肽含量×100%。從圖4看出，葛根素對(duì)各腦區(qū)β-EP的調(diào)節(jié)幅度差異較大（圖4A），調(diào)節(jié)幅度最小為4.57%，最大則高達(dá)38.00%；葛根素對(duì)L-EK的調(diào)節(jié)幅度較小，調(diào)節(jié)幅度最大的是皮層，為17.56%（圖4B）；葛根素對(duì)DnyA的調(diào)節(jié)幅度居中，各腦區(qū)差異較?。▓D4C）。

圖4 葛根素對(duì)慢性乙醇中毒大鼠各腦區(qū)阿片肽含量的調(diào)節(jié)幅度Fig.4 Regulation of puerarin on opioid peptide in the cortex，cerebellum，hippocampus and striatum

3 討論

阿片肽的研究已有30多年的歷史，20世紀(jì)70年代，阿片肽陸續(xù)在體內(nèi)外被發(fā)現(xiàn)，它所具有的類嗎啡活性掀起了科學(xué)家們的研究熱潮。阿片肽是一種神經(jīng)活性物質(zhì)，有激素和神經(jīng)遞質(zhì)的功能，分內(nèi)源性和外源性兩種，內(nèi)源性阿片肽主要包括腦啡肽（leuenkaphalin，L-EK）、內(nèi)啡肽（endorphin，EP）、強(qiáng)啡肽（dynorphin，DnyA）、孤啡肽（orphanin FQ，OFQ）和內(nèi)嗎啡肽（endomorphins，EM）等5大家族。目前對(duì)L-EK、β-EP和DnyA的研究較多，因發(fā)現(xiàn)其有激素和神經(jīng)遞質(zhì)的功能，因此被稱為神經(jīng)免疫肽。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，阿片肽主要涉及了成癮物質(zhì)如乙醇、嗎啡的強(qiáng)化和獎(jiǎng)賞效應(yīng)［5］。但是，近年研究發(fā)現(xiàn)阿片系統(tǒng)也參與了學(xué)習(xí)記憶，其過程非常微妙、復(fù)雜［6］。乙醇對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害可能是通過內(nèi)源性阿片類物質(zhì)介導(dǎo)的這一理論是由Davis等［7］首次提出的。他們發(fā)現(xiàn)，乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛與多巴胺的某種代謝產(chǎn)物相互作用，所產(chǎn)生的生物堿類可以和阿片受體結(jié)合產(chǎn)生阿片樣效應(yīng)，除此之外，乙醇還可通過以下方式興奮內(nèi)源性阿片受體：①乙醇中間代謝產(chǎn)物乙醛與兒茶酚類形成類阿片物質(zhì)加和物；②乙醇可以通過多巴胺和γ－氨基丁酸等遞質(zhì)系統(tǒng)引起內(nèi)源性阿片類物質(zhì)的釋放，間接興奮其受體；③乙醇可非特異性提高內(nèi)源性阿片受體對(duì)阿片類物質(zhì)的敏感性。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明乙醇中毒可影響內(nèi)源性阿片肽的含量和基因表達(dá)，急性乙醇攝入可以增加大腦某些區(qū)域內(nèi)源性阿片肽基因的表達(dá)［8］，慢性乙醇中毒對(duì)阿片肽的影響卻有著諸多不同甚至相反的結(jié)論［9－10］，可能與實(shí)驗(yàn)方法、取材部位及標(biāo)本處理方式不同有關(guān)。

乙醇中毒現(xiàn)象的嚴(yán)重性引發(fā)了眾多學(xué)者對(duì)解酒藥物的研究［11－12］，解酒藥物層出不窮。在我國葛根用于解酒已有4千多年的歷史，葛根素是葛根的主要有效成分之一，因其在體內(nèi)分布廣、消除快、不易積蓄等特點(diǎn)被廣泛用于臨床治療心腦血管疾病。葛根素對(duì)乙醇中毒腦內(nèi)阿片肽的影響研究報(bào)道較少，董學(xué)妍等［13］曾報(bào)道葛根素對(duì)急性乙醇中毒下丘腦阿片肽具有調(diào)節(jié)作用，但葛根素對(duì)慢性乙醇中毒大鼠多腦區(qū)阿片肽的系統(tǒng)干預(yù)研究尚未見報(bào)道。關(guān)于葛根素調(diào)節(jié)內(nèi)源性阿片肽釋放的作用機(jī)制目前還不是很清楚，推測其可能通過降低腦循環(huán)血液中乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛的濃度間接調(diào)節(jié)內(nèi)源性阿片肽的釋放，還可能通過影響多巴胺和氨基酸類遞質(zhì)間接調(diào)節(jié)了阿片肽物質(zhì)的釋放。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性乙醇中毒組大鼠各腦區(qū)L-EK和DnyA含量顯著高于對(duì)照組，葛根素組LEK和DnyA含量較慢性乙醇中毒組降低（圖2，3），說明葛根素可能通過以上機(jī)制調(diào)節(jié)腦內(nèi)L-EK和DnyA含量，對(duì)乙醇中毒大鼠腦組織產(chǎn)生保護(hù)性調(diào)控作用。β-EP的變化與L-EK和DnyA結(jié)果相反，慢性乙醇中毒組各腦區(qū)β-EP的含量比對(duì)照組低，而葛根素組β-EP含量比慢性乙醇中毒組高（圖1），該結(jié)果可能與長期的乙醇攝入降低前阿黑素原基因的表達(dá)，從而減少β-EP的釋放有關(guān)［14］。對(duì)比4個(gè)腦區(qū)葛根素干預(yù)后β-EP、L-EK和DnyA含量的變化幅度（圖4）發(fā)現(xiàn)，葛根素對(duì)各腦區(qū)各指標(biāo)的調(diào)節(jié)幅度不完全一致，對(duì)皮層和小腦調(diào)節(jié)幅度較小，對(duì)海馬和紋狀體調(diào)節(jié)幅度較大。海馬是記憶的主要腦功能區(qū)，其余各腦區(qū)均與機(jī)體的記憶和運(yùn)動(dòng)功能有關(guān)，由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷：葛根素可能對(duì)乙醇中毒所致空間記憶障礙及運(yùn)動(dòng)功能異常有較為顯著的調(diào)控作用，詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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