叢枝菌根真菌孢子最適消毒方法及最佳培養(yǎng)基的研究

趙臘梅，刁亞楠，金海如

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

菌根是自然界中一種普遍的植物共生現(xiàn)象，它是土壤中的菌根真菌菌絲與高等植物營養(yǎng)根系形成的一種聯(lián)合體。由于部分真菌不在根內(nèi)產(chǎn)生泡囊，但都形成叢枝，故簡稱叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）就是這樣一類內(nèi)生菌根真菌，它能與80%的陸地植物建立共生關(guān)系[1-2]，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的所有類型菌根真菌中種類最全、數(shù)量最多的一類真菌。由于AMF屬于專性共生真菌，目前仍未能實現(xiàn)離體培養(yǎng)，只能將其接種在活體根系上或是與其寄主根系一起培養(yǎng)，常用的培養(yǎng)方法有盆栽法和離體雙重培養(yǎng)法。盆栽法的培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)量大，又不便運輸，已較少使用[3]；而離體雙重培養(yǎng)法是目前國際上研究菌根真菌侵染機(jī)理、共生雙方物質(zhì)和信息交換機(jī)制的主要方法[4]，對AMF生理生化研究以及菌劑的生產(chǎn)均有較大的貢獻(xiàn)。

離體條件下真菌孢子的萌發(fā)受多種因素的影響，例如消毒處理、培養(yǎng)基成分、pH酸堿度、重金屬含量、糖含量、孢子密度、孢子自身分泌的抑制物等[5]。而探究AMF孢子的最佳表面消毒處理是實現(xiàn)離體雙重培養(yǎng)的前提。因此，試驗從滅菌方法和培養(yǎng)基兩個方面來優(yōu)化AMF孢子的萌發(fā)最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 根內(nèi)球囊霉菌（Glomus intraradices），由北京農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所“叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫BGC AH01”提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 （A）0.8%瓊脂培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取0.80 g瓊脂溶解于1 00 mL蒸餾水中，pH 6.5，120℃滅菌25 min。（B）0.8%瓊脂蔗糖培養(yǎng)基：稱取0.8 g瓊脂和3 g蔗糖溶解于100 mL蒸餾水中，pH 6.5，120℃滅菌25 min。（C）改進(jìn)的合成培養(yǎng)基[6]：MgSO4720～740 mg/L，KNO370～90 mg/L，KCl 55～75 mg/L，Ca(NO3)2270～290 mg/L，EDTA-鐵鈉鹽5～12 mg/L，MnSO40.01～0.08 mg/L，CuSO40.01～0.03 mg/L，ZnSO40.1～0.4 mg/L，KI 0.01～0.03 mg/L，Na2MoO40.01～0.03 mg/L，CoCl2·6H2O 0.01～0.04 mg/L，H3BO30.3～0.6 mg/L，肌醇40～60 mg/L，維生素B 0.1～0.3 mg/L，吡哆醇0.1～0.3 mg/L，煙酸0.2～0.8 mg/L，pH 6.5，120℃滅菌25 min。（D）發(fā)根培養(yǎng)基：Ca(NO3)2·4H2O 359 mg/L，NaClO 10 mL/L，EDTA-鐵鈉鹽5 mg/L，蔗糖100 mg/L，微量元素1 mL/L，維生素1 mL/L，瓊脂8 mg/L，pH 6.5，120℃滅菌25 min。

1.1.3 主要試劑 用于配制消毒劑的試劑有：氯胺T（上海化學(xué)試劑公司），硫酸鏈霉素（華北制藥股份有限公司），硫酸慶大霉素（西南制藥廠），吐溫20（上海展云化工有限公司），75%酒精溶液等。

1.2 試驗方法

1.2.1 AMF孢子的篩選及提純 取在低溫儲藏的10 g真菌沙子菌樣，參照文獻(xiàn)[7]中的濕篩傾析法分離AMF菌孢子。

1.2.2 消毒液配制 按下述配方配制消毒液：混合消毒劑①，2%氯氨T＋0.05%的吐溫20[8]；混合消毒劑②，200 mg/mL硫酸鏈霉素＋100 mg/mL硫酸慶大霉素[9]；混合消毒劑③，1%氯胺T＋200 mg/L硫酸鏈霉素＋100 mg/L硫酸慶大霉素＋1%吐溫20處理5 min。

1.2.3 AMF孢子的消毒處理 試驗設(shè)計以下3種消毒處理。（1）在無菌條件下，移取0.5 mL孢子溶液到滅過菌的2 mL的離心管中，加入1.5 mL的混合消毒劑①，反復(fù)振蕩消毒30 min后用無菌濾網(wǎng)過濾；將孢子用無菌水清洗干凈后收集到2 mL離心管中，加入混合消毒劑②反復(fù)振蕩消毒25 min，過濾后用無菌水反復(fù)清洗，挑孢子于培養(yǎng)基上備用[10]。（2）將收集的孢子用無菌水沖洗過濾，孢子停留在濾網(wǎng)上；用10 mL 75%酒精浸泡5 s，用無菌水沖洗數(shù)遍；再倒入混合消毒劑③15 mL，浸泡6～7 min后，用無菌水沖洗10遍，挑孢子于培養(yǎng)基上。（3）將收集的孢子用無菌水沖洗過濾，孢子停留在濾網(wǎng)上；用經(jīng)無菌濾膜過濾的混合消毒劑③15 mL，浸泡15 min后，用無菌水沖洗10遍，挑孢子于培養(yǎng)基上。

1.2.4 孢子接種與培養(yǎng)（1）接種。在顯微鏡下操作，將消過毒的孢子用無菌的槍頭挑取到不同培養(yǎng)基上，50個/皿，每種培養(yǎng)基3個培養(yǎng)皿，共4種培養(yǎng)基。（2）培養(yǎng)。接種后，將培養(yǎng)皿置26℃暗箱中培養(yǎng)20 d。在探索最佳消毒方法時采用0.8%瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在探索最適培養(yǎng)基時采用處理3的消毒方法。

1.2.5 統(tǒng)計孢子萌發(fā)率 培養(yǎng)4、8、12、16、20 d時觀察孢子的萌發(fā)情況，以孢子芽管菌絲的長度等于或者大于孢子直徑時作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[11]，統(tǒng)計萌發(fā)率；其中污染的孢子數(shù)不在統(tǒng)計之內(nèi)。采用spss 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，在5%水平下，檢驗不同處理的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對孢子萌發(fā)的影響

從表1中看出，培養(yǎng)4 d時，處理3的萌發(fā)率顯著高于處理1和處理2；隨著培養(yǎng)時間的延長，各處理的孢子萌發(fā)率也不斷提高；培養(yǎng)4～16 d，處理3的孢子萌發(fā)率均顯著高于處理1和處理2，但處理1和處理2之間的孢子萌發(fā)率無顯著差異；培養(yǎng)20 d時，各處理的孢子萌發(fā)率由高到低依次為處理3＞處理2＞處理1，且三者之間的差異均達(dá)顯著水平，處理3的孢子萌發(fā)率比處理1的高22.67個百分點。由此可知，處理3的消毒方法對AMF孢子的傷害性最小，其孢子萌發(fā)最快，萌發(fā)率也最高；而處理1的消毒方法對AMF孢子的傷害性最大，顯著降低了孢子的活力。

表1 不同消毒處理對孢子萌發(fā)的影響 （%）

2.2 不同培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，AMF孢子在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)率表現(xiàn)出一定差異；其中，以A培養(yǎng)基（瓊脂培養(yǎng)基）的效果最好，孢子萌發(fā)快，且萌發(fā)率最高，培養(yǎng)20 d時，孢子萌發(fā)率分別比B、C、D培養(yǎng)基高19.67、32.67、29.00個百分點，且差異顯著；其次是B培養(yǎng)基（瓊脂蔗糖培養(yǎng)基），培養(yǎng)20 d時，孢子萌發(fā)率分別比C、D培養(yǎng)基的萌發(fā)率高13.00、9.33個百分點，且差異顯著；C和D培養(yǎng)基的效果較差，培養(yǎng)20 d時，孢子萌發(fā)率分別為48.00%和51.67%，兩者之間的差異不顯著。這說明，越是營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，對AMF的萌發(fā)越不利。

表2 不同培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)的影響 （%）

3 結(jié)論與討論

3.1 消毒處理

試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，比較了3種不同的表面消毒法對AMF孢子萌發(fā)率的影響。其中，處理1較為常用，但是由于操作不便、消毒時間過長，盡管消毒效果最好，污染率較低，但同時對孢子活力的影響最大，顯著降低了孢子的萌發(fā)率，因此不建議采用。處理2是在仝瑞建等[8]的方法上略做改動，先用75%酒精浸泡5 s，再用1%氯胺T＋200 mg/L硫酸鏈霉素＋100 mg/L硫酸慶大霉素＋1%吐溫20混合液處理5 min，用無菌蒸餾水沖洗5～10次。此方法的孢子萌發(fā)率雖有顯著的提高，但同時污染幾率也相應(yīng)增加。這可能是由于滅菌時間過短，消毒不徹底所造成的。為了解決這一問題，在處理3中做了進(jìn)一步改進(jìn)，即采用無菌過濾膜過濾消毒液，同時延長消毒液的處理時間至15 min，消毒后用無菌蒸餾水漂洗6～10次。該方法顯著降低了孢子培養(yǎng)過程中的污染率，而且對孢子的傷害較小，萌發(fā)率較高，消毒效果明顯。

3.2 培養(yǎng)基

根內(nèi)球囊霉菌的適應(yīng)性很強(qiáng)，萌發(fā)時不需要借助宿主植物[12]，而且其孢子較小，細(xì)胞壁較薄，對環(huán)境敏感，較少用作孢子萌發(fā)試驗材料。試驗中的根內(nèi)球囊霉菌孢子對各處理未表現(xiàn)出敏感現(xiàn)象，這可能因為孢子是AMF的休眠體，對環(huán)境條件不敏感所致[13]。隨著培養(yǎng)時間的延長，孢子的萌發(fā)率不斷提高。在試驗所用的4種培養(yǎng)基中，以瓊脂培養(yǎng)基的孢子萌發(fā)率最高。這種培養(yǎng)基不含大量元素和糖類，孢子的萌發(fā)以及菌絲的生長不受其他元素的影響[14]。觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)12 d時，瓊脂培養(yǎng)基上的孢子就開始長出菌絲，隨后菌絲迅速生長，培養(yǎng)20 d時，其菌絲長度達(dá)35 mm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他培養(yǎng)基中孢子萌發(fā)的長度。而在瓊脂蔗糖培養(yǎng)基中孢子萌發(fā)率降低，可能是原因蔗糖的加入，改變了菌絲的生長環(huán)境，使菌絲難以吸收外界的營養(yǎng)物質(zhì)，從而限制了菌絲的生長[13]，最終導(dǎo)致孢子萌發(fā)率降低。雖然合成培養(yǎng)基和發(fā)根培養(yǎng)基上的孢子萌發(fā)率較低，但這兩種培養(yǎng)基中所含元素最多。研究表明，萌發(fā)菌絲能夠吸收環(huán)境中的很多元素，元素濃度的高低直接影響菌絲活性。例如，Nagahashi等[15]研究不同磷元素濃度對發(fā)芽孢子的影響發(fā)現(xiàn)1 mmol/L的磷元素就能抑制菌絲分支，而當(dāng)磷元素增加至10 mmol/L時，則顯著抑制菌絲的分支及生長；Hepper[16]的研究也表明30 mmol/L K2HPO4能夠抑制Glomus caledonium和Glomus mosseae的萌發(fā)和生長，過量的鹽也會抑制孢子的萌發(fā)以及菌絲的生長；而這些都有可能導(dǎo)致孢子萌發(fā)率的降低。

[1] Smith SE，Read DJ.Myeorrhizal symbiosis[M].UK：Cademic Press London，1997.

[2] Koide R G，Mosse B.A history of research on arbuscular mycorrhiza[J].Mycorrhiza，2004，（14）：145-163.

[3] Gilmore A E.Phytomycetous mycorrhizal organisms collected by open-pot culture methods[J].Hilgardia，1968，39：87-105.

[4]畢銀麗，汪洪鋼，李曉林.VA菌根真菌對轉(zhuǎn)移Ri T-DNA胡蘿卜根器官的侵染[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，1999，5（1）：76-80.

[5] 董昌金，趙 斌.影響叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)的幾種因素研究[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2003，9（4）：489-494.

[6] 金海如.叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產(chǎn)方法[P].中國：CN101565689，2009-05-26.

[7] Gerdemann J W，Nicolson T H.Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting[J].Transactions of the British Mycological Society，1963，46（2）：235-244.

[8] 仝瑞建，楊曉紅，蔣 猛.AM真菌孢子不同消毒方法的優(yōu)化研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，27（6）：781-784.

[9] 董昌金，鄭世學(xué)，趙 斌.球囊霉屬幾種AM真菌孢子表面消毒與萌發(fā)的研究[J].菌物學(xué)報，2003，22（3）：410-416.

[10]田萌萌.叢枝菌根真菌吸收同化外源氮產(chǎn)生精氨酸的研究[D].金華：浙江師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2011.

[11]麻錦敏.AM真菌與紫云英轉(zhuǎn)化根共培養(yǎng)體系的建立和應(yīng)用研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010.

[12]Schreiner R，Koide R T.Streptomycin reduces plant response to mycorrhizal infection[J].Soil Biology&Biochemistry，1993，25：1131-1133.

[13]朱紅惠，姚 青.pH值對Gigaspora margarita孢子萌發(fā)、菌絲生長與聚磷酸鹽含量的影響[J].菌物學(xué)報，2006，25（11）：120-124.

[14]Pawlowska T E，Charvat I.Heavy-metal stress and developmental patterns of arbuscular mycorrhizal fungi[J].Applied and Environmental Microbiology，2004，70（11）：6643-6649.

[15]Nagahashi G，Douds D D，Abney G D.Phosphorus amendment inhibits hyphal branching of the VAM fungus Gigaspora margarita directly and indirectly through its effect on root exudation[J].Mycorrhiza，1996，6（5）：403-408.

[16]Hepper C M.Effect of phosphate on germination and growth of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi[J].Transactions of the British Mycological Society，1983，80：487-490.