張繼成 呂文利 (武警湖北總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430061)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是兒童常見(jiàn)的慢性呼吸道過(guò)敏性疾病，以肺部可逆性阻塞、氣道黏膜炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征。哮喘發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為T(mén)h1/Th2反應(yīng)失衡導(dǎo)致Th2細(xì)胞過(guò)度激活是其重要的免疫學(xué)機(jī)制之一［1］。白細(xì)胞介素13(IL-13)是一種由Th2型細(xì)胞分泌的多效性細(xì)胞因子，介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，與哮喘的發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)。

銀杏葉是治療哮喘的傳統(tǒng)中藥，銀杏葉提取物(EGB)是銀杏葉經(jīng)過(guò)多步驟分離提取后得到的天然活性物質(zhì)。研究證實(shí)，EGB具有廣泛的藥理作用，如拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎及抗過(guò)敏等［2］。臨床研究發(fā)現(xiàn)EGB可以緩解哮喘發(fā)作，但具體機(jī)制尚不清楚。

BPA是生產(chǎn)防碎塑料的原料，廣泛應(yīng)用于從礦泉水瓶、醫(yī)療器械到食品包裝的生產(chǎn)。環(huán)境中的BPA可通過(guò)消化道、呼吸道和皮膚接觸而吸收入體內(nèi)。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BPA與小白鼠患哮喘相關(guān)聯(lián)，初步人體實(shí)驗(yàn)顯示孕婦在妊娠早期受BPA影響可能會(huì)導(dǎo)致嬰兒患哮喘［3，4］。肥大細(xì)胞在哮喘發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，本研究以RBL(大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞)作為肥大細(xì)胞的體外研究模型［5］，通過(guò)BPA刺激活化RBL，觀察EGB對(duì)活化RBL分泌IL-13和PKC活化的影響，探討其治療哮喘的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)胞株 RBL由仲人前教授(上海長(zhǎng)征醫(yī)院)惠贈(zèng)，使用DMEM(含10%新生小牛血清)培養(yǎng)基，在37℃、含5%CO2、飽和濕度的通用條件下培養(yǎng)。

1．1．2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基為GIBCOBRL產(chǎn)品;p-硝基苯基-N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷、BPA均購(gòu)自Sigma;EGB為浙江康恩貝制藥股份有限公司產(chǎn)品;大鼠IL-13 ELISA試劑盒為上海森雄生物工程有限公司分裝; Western blot試劑購(gòu)自北京中杉公司;蛋白酶抑制劑cocktail購(gòu)自上海麥約爾生物技術(shù)公司;山羊抗大鼠PKC多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1．2 方法

1．2．1 噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè) 將 RBL細(xì)胞種入96孔板，每孔2×105細(xì)胞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，第2天用無(wú)血清DMEM洗兩遍，分別加入終濃度為40、80、160μg/ml的EGB，培養(yǎng)30分鐘，再加入BPA(終濃度50μmol/L)，培養(yǎng) 30分鐘。洗兩遍，加入MTT，培養(yǎng)4小時(shí)。吸棄上清液，加入 DMSO，混勻30分鐘后在酶標(biāo)儀上測(cè)A570nm值。

1．2．2 空白組 將 RBL細(xì)胞種入12孔板，每孔6×105細(xì)胞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，第2天用無(wú)血清DMEM洗兩遍，加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)30分鐘，取20μl上清測(cè)定β-氨基己糖苷酶，再繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。

1．2．3 BPA活化RBL組(BPA組) 將RBL細(xì)胞種入12孔板，每孔6×105細(xì)胞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，第2天用無(wú)血清DMEM洗兩遍，加入BPA(終濃度50μmol/L)，培養(yǎng)30分鐘，取上清測(cè)定β-氨基己糖苷酶，再繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。

1．2．4 EGB實(shí)驗(yàn)組 將RBL細(xì)胞種入12孔板，每孔6×105細(xì)胞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，第2天用無(wú)血清DMEM洗兩遍，分別加入終濃度為 40、80、160 μg/ml的EGB，培養(yǎng)30分鐘后，加入BPA(終濃度50μmol/L)，培養(yǎng)30分鐘，取上清測(cè)定β-氨基己糖苷酶，再繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。

1．2．5 β-氨基己糖苷酶分泌測(cè)定 加20μl待測(cè)上清和20μl 5 mmol/L p-硝基苯基-N-乙酰-β-D 氨基葡萄糖苷(溶于0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH4．5)于96孔板，每樣品做三個(gè)復(fù)孔，37℃孵育2小時(shí)，加入 200μl 0．1 mol/L碳酸鈉鹽緩沖液(pH11)終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取405 nm的OD值。用未刺激的RBL加0．1%Triton X-100溶解細(xì)胞后，取上清測(cè)定β-氨基己糖苷酶總活性。按下面公式計(jì)算樣品的β-氨基己糖苷酶釋放(%)，實(shí)驗(yàn)樣品所測(cè)OD值/β-氨基己糖苷酶總活性所測(cè)OD值×100%。

1．2．6 IL-13的檢測(cè) IL-13測(cè)定采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1．2．7 細(xì)胞漿和細(xì)胞膜蛋白提取液的制備 收獲RBL細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，加入300μl緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5，0．25 mmol/L 蔗糖，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA)，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑cocktail，用超聲細(xì)胞粉碎儀粉碎細(xì)胞，每次持續(xù)30秒，間隔3秒，共處理4次。將超聲粉碎后的細(xì)胞勻漿液經(jīng)超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman)超速離心(35 000 r/min 4℃，60分鐘)，取上清液即為胞漿蛋白提取液，在沉淀部分中加入300μl含有蛋白酶抑制劑cocktail的緩沖液B(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5，1% Nonidet P-40，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA)，冰浴30分鐘，超速離心(35 000 r/min 4℃，15分鐘)，上清液即為胞膜蛋白提取液。用BSA法對(duì)細(xì)胞漿和細(xì)胞膜蛋白提取液進(jìn)行蛋白定量。

1．2．8 Western blot檢測(cè) PKC 取30μg蛋白上SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，加一抗(羊抗大鼠PKC)孵育，洗滌后加二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG)孵育，洗滌后用NBT/BCIP試劑盒顯色。掃描膜，計(jì)算機(jī)軟件處理，進(jìn)行密度分析，計(jì)算每組樣本細(xì)胞膜與細(xì)胞漿的灰度比值，以此代表各組細(xì)胞PKC的轉(zhuǎn)位(即PKC活化)情況。

2 結(jié)果

2．1 MTT結(jié)果 各組所測(cè)的A570nm吸光度值無(wú)明顯差異，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所用各濃度EGB對(duì)RBL細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響(表1)。

2．2 EGB對(duì)于BPA活化RBL脫顆粒的影響 未加BPA活化的RBL(空白組)，其自發(fā)的β-氨基己糖苷酶釋放僅為3．8%，加50μmol/L濃度 BPA(BPA組)活化后的RBL，其β-氨基己糖苷酶釋放達(dá)41．6%，與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。加 EGB后，對(duì)BPA活化 RBL釋放 β-氨基己糖苷酶產(chǎn)生了極大地抑制作用，且抑制作用隨EGB使用濃度增加而加大，當(dāng) EGB濃度為160 μg/ml時(shí)，其 β-氨基己糖苷酶釋放降低到18．7%(表2)，與BPA組相比，三種劑量的EGB組差異明顯，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

2．3 EGB對(duì)于BPA活化RBL分泌IL-13的影響RBL活化前，IL-13 分泌量為 33．6 pg/ml，加 50 μmol/L濃度BPA活化后，RBL分泌IL-13明顯增加，達(dá)95.4 pg/ml，與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。加EGB后，對(duì)活化RBL分泌IL-13產(chǎn)生了極大地抑制作用，且抑制作用隨EGB濃度增加而加大，當(dāng)EGB濃度為160μg/ml時(shí)，其IL-13分泌量下降至45．3 pg/ml(表3)，與 BPA組相比，三種劑量的EGB組差異明顯，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 EGB對(duì)RBL細(xì)胞活性的影響 ±s，n=3)Tab．1 Effects of EGB on the RBL cells viability ±s，n=3)

表1 EGB對(duì)RBL細(xì)胞活性的影響 ±s，n=3)Tab．1 Effects of EGB on the RBL cells viability ±s，n=3)

_Groups A570nm Blank group 0．96 ±0．21 BPA(50 μmol/L)group 0．98 ± 0．24 BPA+EGB(40 μg/ml)group 0．97 ±0．17 BPA+EGB(80 μg/ml)group 0．95 ±0．18_BPA+EGB(160μg/ml)group 0．95 ±0．20_____

表2 EGB對(duì)于BPA活化RBL脫顆粒的影響 ± s，n=3)Tab．2 Effects of EGB on the release of β-hexosam inidase from RBL treated with BPA± s，n=3)

表2 EGB對(duì)于BPA活化RBL脫顆粒的影響 ± s，n=3)Tab．2 Effects of EGB on the release of β-hexosam inidase from RBL treated with BPA± s，n=3)

Groups Release of______________________________________β-hexosaminidase(%)Blank group 3．8 ±0．5 BPA(50 μmol/L)group 41．6 ±7．9 BPA+EGB(40 μg/ml)group 33．1 ±6．2 BPA+EGB(80 μg/ml)group 24．3 ±5．1_BPA+EGB(160μg/ml)group 18．7 ±2．9_____

表3 EGB對(duì)于BPA活化RBL分泌IL-13的影響(x ±s，n=3)Tab．3 Effects of EGB on the secretion of IL-13 from RBL treated with BPA(x ± s，n=3)

2．4 EGB對(duì)于活化RBL細(xì)胞PKC轉(zhuǎn)位的影響未加BPA活化時(shí)，RBL胞膜與胞漿PKC的灰度比值為0．11，加50μmol/L濃度 BPA活化后，RBL細(xì)胞中PKC活化，從胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜，胞膜與胞漿PKC的灰度比值上升為1．04，與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。加入EGB后，對(duì)于活化RBL細(xì)胞的PKC轉(zhuǎn)位產(chǎn)生了明顯的抑制作用，當(dāng)EGB濃度為160μg/ml時(shí)，RBL胞膜與胞漿PKC的灰度比值下降為0.25(表4，圖1、2)，與BPA組相比，三種劑量的EGB組差異明顯，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表4 EGB對(duì)于活化RBL細(xì)胞PKC轉(zhuǎn)位的影響 ±s，n=3)Tab．4 Effects of EGB on the translocation of PKC in RBL treated with BPA± s，n=3)

表4 EGB對(duì)于活化RBL細(xì)胞PKC轉(zhuǎn)位的影響 ±s，n=3)Tab．4 Effects of EGB on the translocation of PKC in RBL treated with BPA± s，n=3)

Groups Ratio ofmembrane PKC________________________________________________________tocytosolic_PKC Blank group 0．11 ± 0．03 BPA(50 μmol/L)group 1．02 ± 0．26 BPA+EGB(40 μg/ml)group 0．71 ± 0．22 BPA+EGB(80 μg/ml)group 0．37 ± 0．08 BPA+EGB(160μg/ml)group 0．25 ± 0．06

圖1 PKC在RBL胞膜中的表達(dá)Fig．1 Expression of PKC in themembrane of RBL

圖2 PKC在RBL胞漿中的表達(dá)Fig．2 Expression of PKC in the cytoplasm of RBL

3 討論

哮喘是以肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，多種細(xì)胞參與的變態(tài)反應(yīng)性慢性炎癥性疾病，其中肥大細(xì)胞是哮喘發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞。肥大細(xì)胞表面表達(dá)高親和力IgE受體［6，7］，當(dāng)特異性抗原與肥大細(xì)胞表面兩個(gè)以上的IgE分子結(jié)合，發(fā)生橋聯(lián)反應(yīng)，激活肥大細(xì)胞，活化信號(hào)通過(guò)傳導(dǎo)，激活蛋白激酶C(Protein kinase，PKC)和下游分子，使肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放許多細(xì)胞因子和其它生物活性介質(zhì)，導(dǎo)致平滑肌收縮和微血管通透性升高，并募集炎癥細(xì)胞，引起組織損傷和變態(tài)反應(yīng)。

銀杏葉提取物具有平喘止咳的功效［8］，其有效藥用成分主要包括銀杏黃酮和銀杏萜類內(nèi)酯，因此人們認(rèn)為，其療效與銀杏內(nèi)酯對(duì)血小板激活因子(PAF)的拮抗作用有關(guān)。但是隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)許多比銀杏內(nèi)酯作用更強(qiáng)的PAF受體拮抗劑對(duì)哮喘無(wú)效，而銀杏葉提取物治療哮喘卻取得明顯效果，提示銀杏葉提取物對(duì)哮喘的作用不只是拮抗PAF受體，還存在其它作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究闡明。

本實(shí)驗(yàn)首先研究了EGB對(duì)BPA刺激活化RBL脫顆粒的影響。RBL活化后，通過(guò)脫顆粒釋放包括β-氨基己糖苷酶在內(nèi)的許多生物活性介質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中常常通過(guò)檢測(cè)β-氨基己糖苷酶作為監(jiān)測(cè)活化RBL脫顆粒情況的一個(gè)可靠指標(biāo)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)BPA刺激后，RBL活化并脫顆粒，而加入EGB后，活化RBL細(xì)胞脫顆粒受到了極大地抑制，說(shuō)明EGB具有抗過(guò)敏反應(yīng)的作用。

BPA具有免疫調(diào)節(jié)作用，它能刺激免疫細(xì)胞分泌Th2類細(xì)胞因子，促進(jìn)過(guò)敏性炎癥反應(yīng)發(fā)生［9］。大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)IL-13在哮喘發(fā)病機(jī)制中起中軸作用［10，11］。IL-13可以誘導(dǎo) B細(xì)胞合成 IgE而引發(fā)哮喘，此外，IL-13還專門(mén)表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞，通過(guò)非淋巴細(xì)胞依賴途徑誘導(dǎo)哮喘。IL-13在肺中誘導(dǎo)TGF-β產(chǎn)生，促進(jìn)哮喘患者的肺纖維化。嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)是哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，IL-13誘導(dǎo)eotaxin-1、eotaxin-2和eotaxin-3等細(xì)胞因子表達(dá)于上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上，可促進(jìn)肺部大量EOS浸潤(rùn)。因此，我們通過(guò)ELISA檢測(cè)了各組RBL細(xì)胞分泌的IL-13。研究結(jié)果顯示，未經(jīng)BPA刺激的RBL，其 IL-13分泌量很低，僅33．6 pg/m l;加50μmol/L濃度BPA刺激活化后，RBL分泌IL-13明顯增加，達(dá)95．4 pg/m l，說(shuō)明BPA能活化RBL，使之IL-13分泌增加。加EGB后，對(duì)活化RBL分泌IL-13產(chǎn)生了極大地抑制作用，且抑制作用隨EGB濃度增加而加大，當(dāng)EGB濃度為160μg/ml時(shí)，其IL-13分泌量下降至45．3 pg/m l，說(shuō)明EGB能抑制BPA對(duì)RBL的活化，減少IL-13的分泌。

PKC是肥大細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一個(gè)關(guān)鍵酶［12，13］。肥大細(xì)胞受刺激活化后，胞漿 Ca2+濃度升高，二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解產(chǎn)生第二信使二?；视?DAG)，DAG能與胞漿內(nèi)非活化型PKC結(jié)合，并在膜磷脂和鈣協(xié)同作用下使之活化，使其從胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜，這種轉(zhuǎn)位是PKC活化的標(biāo)志?；罨腜KC能磷酸化細(xì)胞膜蛋白(包括離子通道或受體等)和細(xì)胞骨架蛋白(微管蛋白、微絲蛋白以及肌球蛋白輕鏈)，從而觸發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒。PKC活化后，還可通過(guò)MAPK途徑，使NF-κB活化，分泌細(xì)胞因子和生物活性介質(zhì)。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了EGB對(duì)PKC活化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在活化前，RBL胞膜與胞漿PKC的灰度比值為0．11，經(jīng)BPA刺激活化后，RBL細(xì)胞中的PKC活化，從胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜，胞膜與胞漿PKC的灰度比值為上升為1．02;但是，在加入EGB后，對(duì)于活化RBL細(xì)胞的PKC轉(zhuǎn)位產(chǎn)生了明顯的抑制作用，當(dāng)EGB濃度為160μg/ml時(shí)，RBL胞膜與胞漿PKC的灰度比值下降為0．25。結(jié)果說(shuō)明，EGB通過(guò)抑制PKC活化，進(jìn)而對(duì)RBL活化脫顆粒以及分泌IL-13產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，銀杏葉制劑對(duì)哮喘的治療作用部分可能與其抑制PKC的活化，進(jìn)而抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和分泌IL-13有關(guān)。

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