仿刺參體腔液中酚氧化酶活性的分析

王軼南,穆曉虎,封妮莎,宋堅(jiān),常亞青

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

仿刺參體腔液中酚氧化酶活性的分析

王軼南,穆曉虎,封妮莎,宋堅(jiān),常亞青

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

在 (22±1)℃下抽取體質(zhì)量為95.0～105.0 g的仿刺參Apostichopus japonicas體腔液,制備體腔液及體腔細(xì)胞溶解上清液 (CLS),分別測定其酚氧化酶 (PO)活性,檢測分析不同刺激物 (CaCl2、MgCl2、LPS、SDS、Trypsin和甲醇)對酚氧化酶原 (proPO)系統(tǒng)的激活效果,并比較了不同規(guī)格仿刺參體腔液的酚氧化酶活性。結(jié)果表明:仿刺參體腔液中的PO活性個體差異較大,平均為 (146.90±55.60)U,體腔液與不同激活劑作用后PO活性均無明顯變化;CLS中的PO活性為31.82 U,其在100 mmol/L MgCl2作用后PO活性大幅度提高,proPO比活為43.9 U,CLS與LPS、CaCl2和甲醇作用后PO活性無明顯增加,與SDS和Trypsin作用后PO活性表現(xiàn)出一定的抑制。研究表明,仿刺參體腔液中的PO主要存在于體腔液中, CLS中的PO活性較低,proPO主要存在于體腔細(xì)胞中,可被Mg2+大幅度激活。52.4～68.5、20.7～24.4、4.9～5.6 g 3種規(guī)格的仿刺參體腔液中的PO活性分別為(42.18±7.62)、(34.10±9.28)、(33.29±7.42)U,表明不同規(guī)格仿刺參體腔液中的PO活性存在一定差異,總體呈現(xiàn)隨規(guī)格的增大PO活性增強(qiáng)的趨勢,其中100 g左右的仿刺參與3個較小規(guī)格的仿刺參體腔液中的PO活性存在顯著性差異 (P＜0.05)。

仿刺參;體腔液;酚氧化酶;酚氧化酶原

仿刺參Apostichopus japonicas產(chǎn)于遼寧、山東、河北等北方沿海地區(qū),具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]。近年來,刺參養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展使養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化,導(dǎo)致其病害頻發(fā),因此,對刺參免疫機(jī)制的研究具有重要意義。刺參的體腔液中存在多種免疫因子,已有學(xué)者對刺參機(jī)體酵母菌組成、溶血素、凝集素、溶菌酶等方面進(jìn)行了研究[2-4],而有關(guān)刺參酚氧化酶的研究卻很少。

無脊椎動物由于缺乏真正的抗體,只能依靠先天免疫來抵御外來病原及細(xì)菌的影響,其中酚氧化酶(PO)和酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)激活系統(tǒng)在識別和防御中發(fā)揮重要作用[5-7]。PO一般以無活性的酚氧化酶原形式存在[8],酚氧化酶原激活系統(tǒng)激活后產(chǎn)生的黑色素及其中間產(chǎn)物可通過增強(qiáng)吞噬作用、包囊作用、介導(dǎo)凝集反應(yīng)和產(chǎn)生殺菌物質(zhì)等方式參與宿主防御反應(yīng)。目前,關(guān)于酚氧化酶的研究多集中在節(jié)肢動物和軟體動物中[9],對棘皮動物研究較少。研究發(fā)現(xiàn),管海參Holothuria tubulosa、波羅的海海星Asterias rubens和冠海膽Diadema antillarum等棘皮動物具有酚氧化酶[10]。筆者已對蝦夷馬糞海膽Strongylocentrotus intermedius體腔液的酚氧化酶活性及其酶原激活等進(jìn)行了研究[11],在此基礎(chǔ)上,對仿刺參體腔液的PO進(jìn)行研究,以期為提高仿刺參的免疫功能提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

4種規(guī)格(95.0～105.0、52.4～68.5、20.7～24.4、4.9～5.6 g)的健康仿刺參,購于大連鶴圣豐養(yǎng)殖場,取樣前在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一周。

L-多巴(3,4-dihydroxyl-phenylalanine,L-dopa)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、胰蛋白酶(Trypsin)購自BBI公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 體腔液和體腔細(xì)胞溶解上清液的制備 取體質(zhì)量為95.0～105.0 g的仿刺參10頭,于(22± 1)℃下用一次性注射器抽取其體腔液,以3 000 r/min離心15 min,上清即仿刺參體腔液;將體腔液細(xì)胞沉淀混合,用超聲波破碎,以10 000 r/min離心10 min,上清即仿刺參體腔細(xì)胞溶解上清液(CLS)。

1.2.2 PO活性分析 采用分光光度法測定PO活性[11]。在96孔酶標(biāo)板中加入100 μL體腔液上清或CLS,再加入50 μL L-dopa(3 mg/mL),每隔5 min用酶標(biāo)儀(Biotek,Epoch)測定波長為492 nm處的OD值,試驗(yàn)設(shè)3個平行。采用考馬斯亮藍(lán)法測定體腔液上清和CLS中的蛋白濃度。按PO酶活定義1 U=OD492nm/(min·mg蛋白)計(jì)算酶活性。

1.2.3 proPO激活及活性測定 取100 μL體腔液或CLS,加入50 μL激活劑,于37℃下水浴15 min,再加入50 μL L-dopa后,按上述方法測定PO活性。激活劑包括CaCl2(100 mmol/L)、MgCl2(100 mmol/L)、LPS(1 mg/mL)、SDS(1 mg/mL)、Trypsin(1 mg/mL)和甲醇(體積分?jǐn)?shù)為50%),每種激活劑設(shè)3個平行。對照組加入50 μL滅菌純水。

1.2.4 不同規(guī)格仿刺參體腔液中的PO活性 隨機(jī)選取體質(zhì)量規(guī)格分別為 52.4～68.5、20.7～24.4、4.9～5.6 g的仿刺參各3頭,按上述方法抽取體腔液并離心,收集體腔液,用酶標(biāo)儀測定其PO活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析,利用單因素方差分析法 (ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析,用Duncan法進(jìn)行多重比較,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 PO活性

仿刺參體腔液與L-dopa反應(yīng)后OD492nm值持續(xù)上升,以O(shè)D492nm在90 min中平均增加速率計(jì)算PO活性,仿刺參體腔液中的 PO活性為 (146.90± 55.60)U;CLS中的PO活性為31.82 U。本研究結(jié)果表明,仿刺參體腔液中的PO主要存在于體腔液中,且個體差異較大。

2.2 激活劑對proPO的作用

體腔液與激活劑作用后,PO活性無明顯變化,且未檢測到proPO存在。相比未激活的對照組,在100 mmol/L MgCl2作用下,CLS中的PO活性升高, CLS中的 proPO比活為 43.9 U;CLS與 LPS、CaCl2、甲醇作用后PO活性的變化較小,而與SDS及Trypsin作用后PO活性略有降低 (圖1)。本研究結(jié)果表明,仿刺參體腔液中的體腔細(xì)胞含有少量proPO,且可被Mg2+激活。

圖1 不同激活劑對仿刺參CLS中PO活性的影響Fig.1 Effects of different activators on phenoloxidase activity in coelomocyte lysate of sea cucumber Apostichopus japonicus

2.3 不同規(guī)格仿刺參PO活性的比較

不同規(guī)格仿刺參體腔液中的PO活性存在一定差異,體質(zhì)量規(guī)格為52.4～68.5、20.7～24.4、4.9～5.6 g的仿刺參 PO活性分別為(42.18± 7.62)、(34.10±9.28)、(33.29±7.42)U,與體質(zhì)量為95.0～105.0 g的仿刺參體腔液中的PO活性(146.90 U±55.60 U)相比,不同規(guī)格仿刺參體腔液中的PO活性存在一定差異,總體呈現(xiàn)隨規(guī)格的增大PO活性增強(qiáng)的趨勢 (圖2)。多重比較結(jié)果表明,100 g左右的仿刺參與3個較小規(guī)格的仿刺參體腔液中的PO活性存在顯著性差異(P＜0.05), 3個較小規(guī)格之間均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 不同規(guī)格仿刺參體腔液中PO活性的比較Fig.2 Phenoloxidase activity in sea cucumber individuals with different body weight

3 討論

3.1 仿刺參體腔液中proPO及PO的定位

用蛋白酶或去污劑激活從貽貝血淋巴中分離血漿和血細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),血漿中的proPO遠(yuǎn)低于血細(xì)胞中的含量,證明proPO同時存在于貽貝的血漿和血細(xì)胞中,而且血細(xì)胞是其主要儲存場所[12-13]。除了血淋巴外,在受病毒感染的中國對蝦不同組織中可檢測到不同水平的PO活性[14]。本研究結(jié)果顯示,仿刺參體腔液中的proPO存在于體腔細(xì)胞中,不僅與上述研究結(jié)果一致,而且與對蝦夷馬糞海膽PO定位的研究結(jié)果相吻合[11]。關(guān)于仿刺參其他組織細(xì)胞中是否存在proPO,還有待進(jìn)一步研究。

中華絨螯蟹血淋巴的血清和血細(xì)胞裂解上清液中都存在PO活性,血漿中無PO,血清中的PO來自于血細(xì)胞[15]。太平洋牡蠣、扇貝、小獅爪海扇蛤以及江珧4種軟體動物成體的血漿和血細(xì)胞中均存在PO活性[16]。對蝦夷馬糞海膽的研究發(fā)現(xiàn),血漿是PO存在的主要場所,CLS中的PO活性很小。本研究結(jié)果表明,仿刺參體腔液中的PO既存在于體腔液中也存在于CLS中,與之前研究結(jié)果一致。

3.2 仿刺參體腔液中proPO的激活

PO多以酶原形式存在于無脊椎動物的血淋巴中,可被內(nèi)源性激活系統(tǒng)或外源性激活劑激活[8]。不同激活劑對proPO的激活機(jī)理不同,激活方式一般有兩種:酶原的蛋白裂解和去污劑 (或變性劑)激活。加熱和二價陽離子也對proPO的激活起促進(jìn)作用[7]。此外,有研究表明,氨氮脅迫對三疣梭子蟹 proPO也會產(chǎn)生影響[17]。不同種類動物的proPO所適應(yīng)的激活劑也不同,Trypsin對南美白對蝦、克氏原螯蝦和海膽的proPO有激活作用,而對斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦的 proPO激活效果不明顯[18-20]。在棘皮動物中,Trypsin可以激活管海參體腔液中的proPO,Trypsin和MgCl2可以激活蝦夷馬糞海膽的proPO。本研究中發(fā)現(xiàn),只有MgCl2對仿刺參體腔液中的proPO具有激活作用,Trypsin則表現(xiàn)出一定的抑制作用,與海膽略有差異。

3.3 仿刺參PO活性及其與個體規(guī)格的關(guān)系

體質(zhì)量為18～26 g的蝦夷馬糞海膽體腔液中的PO活性為 (48.28±6.69)U[11]。本研究中測得體質(zhì)量為100 g左右的仿刺參體腔液中的PO活性為 (146.90±55.60)U,較小規(guī)格的仿刺參體腔液中的PO活性也可達(dá) (33.29±7.42)U。在以往關(guān)于棘皮動物體腔液PO活性的研究中,因體腔液與L-dopa作用后OD值變化不明顯,其PO活性往往被忽略。這主要是棘皮動物體腔液中的蛋白濃度較低造成的。因涉及物種、規(guī)格或成熟度等因素,不同動物之間的PO活性無法做深入比較,但僅就測得的數(shù)值而言,棘皮動物的PO活性并不低。南美白對蝦血細(xì)胞溶解上清液中的PO活性為 (6.19± 3.25)U[21],棉鈴蟲血細(xì)胞中的PO活性相對血漿較高,但也僅為 (0.77±0.10)U[22]。

不同規(guī)格仿刺參體腔液中的PO活性不同,總體呈現(xiàn)隨體質(zhì)量的增加活性增強(qiáng)的趨勢。有關(guān)年齡增長與機(jī)體免疫力關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn),年齡與免疫系統(tǒng)的功能相關(guān)聯(lián)。隨著年齡的增長,特異性免疫減弱,而先天性免疫則表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng),在無脊椎動物中,細(xì)胞免疫、體液免疫以及相關(guān)基因的表達(dá)都發(fā)生相應(yīng)的變化[23]。與本研究相似,較大規(guī)格的切葉蟻Acromyrmex octospinosus的PO活性較小規(guī)格的顯著升高[24]。此外,雄性紅蘭蝦 Aristeus antenmztus和中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis的超氧化物歧化酶 (SOD)活性隨體長的增加而增大[25];大規(guī)格克氏原螯蝦 (120 g±20 g)的血藍(lán)蛋白含量以及溶菌酶和SOD活性均大于小規(guī)格(27 g±2 g) 的[26];大齡的線蟲Caenorhabditis elegans則對病原表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗力[23]。有些魚類的免疫功能指標(biāo)也和體長相關(guān),大西洋鱈和大鱗大麻哈魚Oncorhynehus tshawytsch免疫參數(shù)的大多數(shù)指標(biāo)隨體長的增加而增大[27]。

[1] 常亞青,丁君,宋堅(jiān),等.海參、海膽生物學(xué)研究與養(yǎng)殖[M].北京:海洋出版社,2004.

[2] 李明,馬悅欣,劉志明,等.刺參機(jī)體酵母菌組成及其拮抗活性的研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2012,27(5):436-440.

[3] 馬悅欣,許珂,王銀華,等.K-卡拉膠寡糖對仿刺參溶菌酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報,2010,25(3):224-227.

[4] 李丹彤,宋亮,鐘莉,等.刺參凝集素的分離純化及其性質(zhì)[J].水產(chǎn)學(xué)報,2005,29(5):654-659.

[5] Ana P M,Claudia M,Alicia M S,et al.Patagonicosidea novel antifungal disulfated triterpene glycoside from the sea cucumber Psolus patagonicus[J].J Tetra Hedron,2001,57:9563-9568.

[6] Haug T,Kjuul A K,Styrvold O B,et al.Antibacterial activity in Strongylocentrotus droebachiensis(Echinoidea),Cucumaria frondosa(Holothuroidea)and Asterias rubens(Asteroidea)[J].Invertebr Pathol,2002,81:94-102.

[7] 龐秋香,龐書香,趙博生.酚氧化酶及其酶原的生化特性與分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,8(1):196-200.

[8] 李國榮,張士璀,李紅巖,等.酚氧化酶研究概況Ⅰ——特性、功能、分布和在胚胎發(fā)育中的變化[J].海洋科學(xué),2003,27 (4):4-8.

[9] 吳曙,王淑紅,王藝?yán)?等.軟體動物和甲殼動物酚氧化酶的研究進(jìn)展[J].動物學(xué)雜志,2009,44(5):137-146.

[10] Smith V J,Soderhall K.A comparison of phenoloxidase activity in the blood of marine invertebrates[J].Dev Comp Immunol,1991 (4):251-61.

[11] 王軼南,劉學(xué)偉,劉艷萍,等.蝦夷馬糞海膽Strongylocentrotus intermedius體腔液的酚氧化酶活性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報,2011,13(2):116-120.

[12] Coles J A,Pipe R K.Phenoloxidase activity in the haemolymph and haemocytes of the marine mussel Mytilus edulis[J].Fish& Shellfish Immunol,1994,4:337-352.

[13] Asokan R,Arumugam M,Mullainadhan P.Activation of prophenoloxidase in the plasma and haemocytes of the marine mussel Pernaviridis linnaeus[J].Dev Comp Immunol,1997,21(1):1-12.

[14] 劉曉云,張志峰,于利,等.中國對蝦組織細(xì)胞中酚氧化酶活力的研究[J].高技術(shù)通訊,2002(8):89-92.

[15] 陸宏達(dá),劉凱,張明輝.中華絨螯蟹血淋巴中酚氧化酶的部分生化特性[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報,2007,16(3):464-471.

[16] Luna G A,Maeda M A,Vargas A F.Phenoloxidase activity in larval and juvenile homogenates and adult plasma and haemocytes of bivalve molluscs[M].Fish&Shellfish Immunol,2003,15(4): 275-282.

[17] 岳峰,潘魯青,謝鵬,等.氨氮脅迫對三疣梭子蟹酚氧化酶原系統(tǒng)和免疫指標(biāo)的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2010,17(4):761-770.

[18] Aspan A,Huang T S,Cerenius L,et al.cDNA cloning of prophenoloxidase from the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus and its activation[J].Proc Natl Acad Sci,1995,92:939-943.

[19] Sung H H,Chang H J,Her C H,et al.Phenoloxidase activity of hemocytes derived from Penaeus monodon and Macrobrachium rosenbergii[J].Journal of Invertebrate Pathology,1998,71:26-33.

[20] 嚴(yán)芳,章躍陵,羅活強(qiáng),等.凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白酚氧化酶活性的研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2008,27(1):5-8.

[21] 劉凱.南美白對蝦血細(xì)胞中酚氧化酶原系統(tǒng)的激活[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(1):27-32.

[22] 尹麗紅,王琛柱,欽俊德.棉鈴蟲血淋巴酚氧化酶活性的微量測定[J].昆蟲知識,2001,38(2):119-122.

[23] DeVeale B,Brummel T,Seroude L.Immunity and aging:the enemy within?[J].Aging Cell,2004,3(4):195-208.

[24] Armitage S A,Boomsma J J.The effects of age and social interactions on innate immunity in a leaf-cutting ant[J].Journal of Insect Physiol,2010,56(7):780-787.

[25] Mourente G,Diaz-salvago E.Characterization of antioxidant systems,oxidation status and lipids in brain of wild-caught size-class distributed Aristeus antennatus(Risso,1816)crustacea,Decapoda [J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,1999,124(4):405-416.

[26] 于寧,華雪銘,趙朝陽,等.野生克氏原螯蝦的肌肉生化成分、組織消化酶和免疫酶活性分析[J].海洋漁業(yè),2011,33(1): 46-52.

[27] Harrahy L N,Schreck C B,Maulr A G.Antibody-producing cells correlated to body weight in juvenile chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha acclimated to optimal and elevated temperatures[J]. Fish&Shellfish Immunology,2001,11(8):652-659.

Analysis of phenoloxidase activity in the coelomic fluid of sea cucumber Apostichopus japonicus

WANG Yi-nan,MU Xiao-hu,FENG Ni-sha,SONG Jian,CHANG Ya-qing
(Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

In this study we extracted coelomic fluid of sea cucumber Apostichopus japonicus(95.0-105.0 g),collected plasma and haemocyte lysate(CLS)respectively,measured phenoloxidase(PO)activity and then analysed the induction of different activators to the proPO system.In addition,we compared PO activity of different sizes of sea cucumber.The results showed that PO activities of sea cucumber,varied among differentin dividuals(146.90± 55.60)U.There were no obvious change in PO activity after being inducedby different activities.The PO activity of CLS was 31.82 U,which could be increased by 100 mmol/L MgCl2induction.The activity of proPO was 43.9 U,PO activity had no obvious increase after treatments by LPS,SDS,CaCl2,Trypsin and methanol.SDS and Trypsin even showed inhibition effects.The findings suggested that PO of the coelomic fluid of sea cucumber was mainly distributed in plasma and proPO existed in coelomic cells which were greatly activated by Mg2+.PO activity of different sizes of sea cucumber(52.4-68.5,20.7-24.4 g and 4.9-5.6 g)were(42.18±7.62),(34.10± 9.28)U and(33.29±7.42)U respectively.It suggested that PO activity varied with different size of sea cucumber.Bigger individuals seemed showing higher PO activity.The PO activity of the maximal individuals(about 100 g)was significantly higher than that of the smaller ones(P＜0.05).

Apostichopus japonicus;coelomic fluid;polyphend oxidase(PO);proPO

S968.9

:A

2095-1388(2013)04-0319-04

2012-11-30

國家 “863”計(jì)劃項(xiàng)目 (2012AA100812);國家星火計(jì)劃項(xiàng)目 (2012GA651002);國家海洋局海洋公益項(xiàng)目 (201105007);遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 (L2012263)

王軼南 (1980-),女,助理研究員。E-mail:wangyinan@dlou.edu.cn

常亞青 (1967-),男,博士,教授。E-mail:yqchang@dlou.edu.cn