穿心蓮給藥后大鼠糞便處理方法的考察

宋 輝，楊 波，王學(xué)志，白 晶，李文蘭

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076；2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076）

0 引 言

傳統(tǒng)中藥使用方法以口服劑型為主，藥物中的有效成分在進(jìn)入消化道之后，除了消化系統(tǒng)的消化作用外，還不可避免地與腸道菌群發(fā)生代謝關(guān)系。由于受糞便的吸附作用和腸內(nèi)菌落的代謝速率影響，這些化學(xué)成分的原型及代謝產(chǎn)物在消化道中會有殘留；同時一些藥物在體內(nèi)不能通過腎臟代謝，經(jīng)過膽汁排泄到腸道中隨糞便排出體外，所以，進(jìn)入體內(nèi)的絕大部分藥物都能在糞便中檢測到。因此，通過分析鑒定糞便中的化學(xué)成分也能夠間接地反映中藥藥效物質(zhì)構(gòu)成。

中藥穿心蓮是爵床科植物穿心蓮Andrographispaniculata（burm.f.）Nees的地上部分，具有清熱解毒、涼血消腫的功效?，F(xiàn)代藥理研究法表明穿心蓮具有清熱抗炎、抗心血管疾病、抗感染、抗氧化、抗生育、抑制腫瘤細(xì)胞生長等多種藥理作用[1－5]，作為抗病毒中藥廣泛應(yīng)用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮對雄性大鼠精子的形成具有顯著性影響，雌鼠不易受孕[6－7]，具有一定的生殖毒性。為了從體內(nèi)過程追蹤其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，分析大鼠口服給藥后糞便的成分，尋找成分間的相互作用規(guī)律，本實驗對糞便的處理方法進(jìn)行優(yōu)化，以期減少糞便中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，獲取更多入糞的成分信息，初步分析糞便中成分的來源，為下一步糞便中的成分分析及其生殖毒性物質(zhì)基礎(chǔ)揭示提供科學(xué)理論的依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀 器

Waters高效液相（HPLC）系統(tǒng)（W2695泵、W2996DAD檢測器、自動進(jìn)樣器、Empower化學(xué)工作站）；分析天平（ALC-110.4上海人和科學(xué)儀器有限公司）；恒溫水?。―K80上海一恒科技有限公司）；臺式低溫離心機(jī)（Avanti 30美國BECKMAN）；超聲震蕩儀（H66MC美國奧好斯科技有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DK-80上海一恒科技有限公司）；XW-80A型快速蝸旋器。

1.2 藥品和試劑

穿心蓮 [Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees.]（哈爾濱市盛泰中藥飲片加工廠，批號：080501）。乙腈、甲醇（色譜純，山東禹王）；甲酸（色譜純，上?？其J）；自制超純凈水等。

1.3 動 物

Wistar雄性大鼠（由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心提供），體重180～240g，批號SCXK-（黑）2006-2010。

2 實驗方法

2.1 灌胃溶液的制備

精密稱取100g穿心蓮全葉藥材，95%乙醇3倍量溫浸2h后，回流提取3次。每次的回流時間及溶劑用量分別為第一次10倍量提取1.5h、后2次用7倍量提取1h，合并提取液，55℃左右減壓回收乙醇，濃縮至1／3體積。保存于冰箱備用。實驗時用蒸餾水溶解，制成相當(dāng)于生藥8g／mL的灌胃藥液備用[7]。

2.2 體外藥材溶液的制備

稱取浸膏（1g生藥材），甲醇充分溶解，定容至10mL容量瓶，過0.45μm濾膜，得待測溶液。

2.3 對照品溶液的制備

分別稱取穿心蓮內(nèi)酯1mg、脫水穿心蓮內(nèi)酯1 mg，甲醇充分溶解，定容至10mL的容量瓶，過0.45μm濾膜，得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry ShieldTM RP18（3.9mm×150mm，5μm）；保護(hù)柱：Nova-PakC18Guard-PakTM；進(jìn)樣量：20μL；流動相：乙腈-0.2%甲酸水溶液洗脫系統(tǒng)；流速：0.8mL／min；柱溫：30℃；檢測波長：275nm。流動相梯度變化程序見表1。

表1 流動相梯度變化程序表Table1 Gradient elution program of mobile phases

2.5 空白及含藥糞便的收集

取Wistar大鼠4只，稱重，給藥組按照依據(jù)8 g生藥／100g劑量灌胃，即1mL／100g給予灌胃藥液，空白組給予相應(yīng)體積的蒸餾水，每次間隔12h，連續(xù)給藥3d，于末次給藥后放入代謝籠中，收集0～24h糞便，置于－20℃冰箱中冷凍保存，備用。

2.6 糞便樣品處理方法考察

針對糞便中化學(xué)成分的復(fù)雜性，并且極性大的成分較多，以及糞便中內(nèi)源性成分的干擾，本實驗采取以下3種方法對糞便進(jìn)行預(yù)處理。

1）SPE固相萃取法 取大鼠給藥組糞便混合，用研缽研碎，稱取2.0g，加10倍量甲醇超聲提取30min，2次，濾過，減壓回收甲醇至干，用2mL色譜甲醇溶解，0.22μm微孔濾膜過濾，取1mL過濾液上SPE小柱純化，用2mL甲醇與1mL乙腈洗脫，合并洗脫液，減壓回收至干，殘渣用1mL色譜甲醇溶解，0.22μm微孔濾膜過濾為含藥糞便供試品溶液；同法制備空白糞便供試品溶液。

2）乙酸乙酯萃取法 取大鼠給藥組糞便混合，用研缽研碎，稱取2.0g，加10倍量甲醇超聲提取30min，2次，濾過，減壓回收甲醇至干，用4 mL蒸餾水溶解，用2倍量乙酸乙酯萃取2次，取乙酸乙酯層，減壓回收至干，用0.75mL甲醇超聲溶解，0.22μm微孔濾膜過濾為含藥糞便供試品溶液；同法制備空白糞便供試品溶液。

3）正丁醇萃取法 取大鼠給藥組糞便混合，用研缽研碎，稱取2.0g，加10倍量甲醇超聲提取30min，2次，濾過，減壓回收甲醇至干，用4 mL蒸餾水溶解，每次加2倍量水飽和的正丁醇溶液，萃取3次，合并萃取液，減壓回收至干，用1.0mL色譜甲醇超聲溶解，0.22μm微孔濾膜過濾為含藥糞便供試品溶液；同法制備空白糞便供試品溶液。

根據(jù)以上3種方法，篩選出處理步驟最少且雜質(zhì)峰較少、峰形較好的糞便處理方法。

2.7 糞便樣品HPLC圖譜的測定

分別吸取含藥糞便供試品溶液及空白糞便供試品溶液各20μL、體外藥材溶液及對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄70min的色譜圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 最佳糞便樣品處理方法

通過分析乙酸乙酯萃取法液相色譜圖（圖1）可知，乙酸乙酯對于極性較弱的成分吸收選擇性較好，對于強(qiáng)極性成分選擇性差，導(dǎo)致較多成分丟失，檢測到的成分太少，不符合實驗要求。

通過分析正丁醇萃取法液相色譜圖（圖2）可知，水飽和正丁醇提取法提取的成分在當(dāng)前液相條件下分離度較差，成分也較少，不符合實驗要求。

通過分析SPE固相萃取法的液相圖譜（圖3），并與正丁醇萃取法和乙酸乙酯萃取法進(jìn)行對比可以發(fā)現(xiàn)，固相萃取法的選擇性好，提出成分多，引入雜質(zhì)少，對樣品起到了很好的純化作用，可作為含藥糞便的處理方法。

3.2 體內(nèi)糞便HPLC圖譜的建立

對比含藥糞便、空白糞便、體外藥材及對照品的HPLC圖譜（圖4）可以發(fā)現(xiàn)，在含藥糞便中發(fā)現(xiàn)19個成分，通過對比逐個峰的色譜圖與光譜圖，結(jié)果顯示，3、5、7、8、12、15、16、17、18、19號峰為原型成分，1、2、4、6、9、10、11、13、14號峰推測其為體內(nèi)代謝產(chǎn)物；與對照品對比發(fā)現(xiàn)，12號峰為脫水穿心蓮內(nèi)酯。

4 結(jié) 論

目前對穿心蓮的藥效作用研究比較廣泛，但研究大多限于其解熱、抗菌、抗炎等藥理學(xué)作用。關(guān)于穿心蓮的生殖毒性及其物質(zhì)基礎(chǔ)，至今尚未見翔實的研究報道。本實驗在前期實驗已明確具有生殖毒性的劑量下給藥3d后的糞便成分進(jìn)行分析，篩選出最佳糞便處理方法，建立穿心蓮糞便指紋圖譜，為下一步利用質(zhì)譜技術(shù)分析其成分，代謝途徑及其結(jié)構(gòu)演變提供支持，結(jié)合同步進(jìn)行的該藥材在血液及尿液中成分分析，揭示其生殖毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而為優(yōu)化穿心蓮臨床使用的正確用法、用量，增強(qiáng)用藥的安全性提供參考依據(jù)。

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