巴西橡膠樹HbNTL1基因啟動(dòng)子的克隆與序列分析

康桂娟 黎瑜 曾日中 聶智毅

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，儋州 571737）

植物特有的NAC（NAM，ATAF1/2和CUC2）轉(zhuǎn)錄因子組成了植物基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［1]。膜結(jié)合NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中一類C端具有跨膜結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，該類膜結(jié)合NAC蛋白依靠此結(jié)構(gòu)錨著在細(xì)胞膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上［3-8]。到目前為止，已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine maxL.）、玉米（Zea mays）、葡萄（Vitis viniferaL.）、水稻（Oryza sative）和毛果楊（Populus trichocarpa）等多種陸生植物中發(fā)現(xiàn)具有多個(gè)NTLs［1，4，6，8-11]。

NAC家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物體生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫應(yīng)答以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［1，12-13]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受非生物脅迫的誘導(dǎo)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［1，6，8]。Kim等［5，8]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥NTLs基因受多種生物和非生物脅迫條件誘導(dǎo)，并且可以調(diào)節(jié)擬南芥的開花時(shí)間。研究結(jié)果顯示，水稻OsNTL基因與擬南芥相似，都可以被多種非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)［8]。Puranik等［1]研究發(fā)現(xiàn)谷子膜結(jié)合SiNAC基因可能與脅迫和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控相關(guān)，可以被滲透脅迫、鹽脅迫、乙烯和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)從橡膠樹中克隆了HbNTL1基因的全長(zhǎng)cDNA序列，在此基礎(chǔ)上，利用基因組步移（Genome Walker）方法克隆了該基因的啟動(dòng)子序列，并通過生物信息學(xué)軟件分析其核心啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)、順式作用元件及其生物學(xué)功能，旨在為進(jìn)一步研究HbNTL1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控以及其在橡膠樹抵御逆境脅迫中的作用提供信息和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）無性系熱研7-33-97種植在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，幼葉液氮研磨后凍存在-80℃，用于基因組DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 巴西橡膠樹基因組DNA的提取 橡膠樹基因組DNA的提取采用改進(jìn)的CTAB法［16]。

1.2.2HbNTL1基因啟動(dòng)子的克隆 啟動(dòng)子克隆采用基因組步移的方法，Genome Walker文庫(kù)由本研究組夏可燦等按Universal Genome WalkerTMKit（Clontech）使用說明書構(gòu)建［17]。根據(jù)HbNTL1轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)巢式PCR特異性引物：5'-CTCTGTGGCCCGGTTTGTCTTGGAACCA-3'（NTLGSP1）和5'-GTGAAGCCGCAGAATCACCACGTGCCA-3'（NTLGSP2）。上游引物為Universal Genome WalkerTMKit自帶的接頭引物AP1和AP2，以PvuII，EcoRV，StuI和DraI酶切連接的產(chǎn)物為模板，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 25 s，72℃ 3 min，7個(gè)循環(huán)；94℃ 25 s，67℃3 min，32個(gè)循環(huán)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用Softberry（http：//linu x1.softberry.com/berry.phtml）網(wǎng)站的TSSP（植物啟動(dòng)子預(yù)測(cè)）數(shù)據(jù)庫(kù)分析了所克隆得到的可能為巴西橡膠樹HbNTL1轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子的序列；利用Berkeley Drosophila Genome Project（BDGP）的在線軟件Neural Network Promoter Prediction Promoter（http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測(cè)核心啟動(dòng)子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和搜索植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）對(duì)啟動(dòng)子序列中可能存在的順式作用元件進(jìn)行分析［18]。

2 結(jié)果

2.1 橡膠樹HbNTL1基因啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)橡膠樹HbNTL1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)巢式PCR特異性引物NTLGSP1和NTLGSP2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，兩輪PCR擴(kuò)增后得到約2.0 kb的條帶（圖1），將PCR產(chǎn)物連接pMD18-T vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與已知序列比對(duì)分析，去除載體、接頭引物和與讀碼框重疊序列，得到橡膠樹HbNTL1基因上游非編碼區(qū)1 718 bp的序列。

2.2 HbNTL1基因啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析

在線軟件TSSP預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbNTL1基因5'非編碼區(qū)序列存在一個(gè)可能的啟動(dòng)子區(qū)，位置在1 513 bp處，一個(gè)對(duì)應(yīng)的TATA框，位置在1 484 bp處，一個(gè)增強(qiáng)子CAAT-box，在1 436 bp處（圖2）。BDGP在線軟件Neural Network Promoter Prediction Promoter預(yù)測(cè)HbNTL1基因的核心啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，結(jié)果（圖2）顯示，HbNTL1基因5'非編碼區(qū)序列中含有真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域（1 473-1 522 bp），其中+1位置的堿基A是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，位于翻譯起始位點(diǎn)（ATG）上游206 bp處。HbNTL1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)堿基為A，TATA-box在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-30 bp處，符合高等植物啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)特征。

利用在線軟件PlantCARE和PLACE對(duì)HbNTL1基因啟動(dòng)子序列中可能含有的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除具有12個(gè)拷貝的TATA-box和CAAT-box外，還具有9個(gè)赤霉素、脫落酸和茉莉酸等激素響應(yīng)元件（ABRE、GAREAT、 P-box、TATC-box和TGACG-motif）、56個(gè)逆境脅迫響應(yīng)元件（ACGTATERD1、ARE、CCAATBOX1、CURECORECR、DOFCOREZM、HSE、MYBCORE、TC-rich repeats、W-box）、6個(gè)光順式反應(yīng)元件（GAG-motif、GATA-box和G-box）、28個(gè)組織特異性表達(dá)元件（CACTFTPPCA1、GTGANTG10、POLLEN1LELAT52、ROOTMOTIFTAPOX1和RY-repeat）以及2個(gè)拷貝的晝夜節(jié)律控制元件（Circadian）等（表1）。

表1 HbNTL1啟動(dòng)子區(qū)域主要順式作用元件分析

3 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、器官建成、激素調(diào)節(jié)以及生物和非生物脅迫應(yīng)答等方面具有重要作用［1，2]。但是對(duì)于NAC類轉(zhuǎn)錄因子的研究還主要集中在基因的克隆與轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析上，而對(duì)他們的上游調(diào)控因子和下游靶標(biāo)基因都不是很清楚。本研究在已知巴西橡膠樹膜結(jié)合NAC轉(zhuǎn)錄因子HbNTL1基因cDNA序列的基礎(chǔ)上，利用Genome Walker的方法獲得了其5'調(diào)控序列1 718 bp，通過在線軟件的預(yù)測(cè)與分析該序列具有真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域和大量的順式作用元件。HbNTL1基因啟動(dòng)子序列中存在多個(gè)激素響應(yīng)元件、光作用順式元件和組織特異性表達(dá)元件，因此，HbNTL1的表達(dá)可能受到光信號(hào)和激素的調(diào)控，并且存在組織特異性。

HbNTL1基因啟動(dòng)子序列中含有大量的逆境脅迫響應(yīng)元件，占到了總數(shù)的50%左右。MYBCORE和MYCCONSENSUSAT元件在HbNTL1基因啟動(dòng)子序列中共發(fā)現(xiàn)有15個(gè)拷貝，這些元件分別是MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別位點(diǎn)，與其相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子在ABA信號(hào)通路和非生物脅迫應(yīng)答中具有重要作用［19，20]。ABRE元件是脫落酸響應(yīng)元件，在干旱、脫水、鹽和低溫等非生物脅迫時(shí)誘導(dǎo)植物體內(nèi)積累脫落酸，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)［21]。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)HbNTL1基因啟動(dòng)子序列中包含了14個(gè)拷貝的DOFCOREZM元件，該元件是Dof 轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別位點(diǎn)，調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞特異基因的表達(dá)，在植物防御過程中具有重要作用［22]。在HbNTL1基因啟動(dòng)子中還發(fā)現(xiàn)有14個(gè)拷貝的W-box元件，該順式作用元件是WRKY轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別位點(diǎn)。植物特有的WRKY基因通過與順式作用元件W-box特異結(jié)合調(diào)控下游目標(biāo)基因表達(dá)，與植物的防御反應(yīng)、逆境應(yīng)答、衰老信號(hào)和生長(zhǎng)發(fā)育等密切相關(guān)［23，24]。ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、MYCCONSENSUSATHSE和W-box等反應(yīng)元件在其他植物脅迫逆境相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域都有報(bào)導(dǎo)［1，2，10，25-28]。HbNTL1基因啟動(dòng)子序列中這些反應(yīng)元件的大量存在表明，HbNTL1可能是一個(gè)逆境脅迫相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子（stress-responsive NAC），在橡膠樹抵抗逆境脅迫的生理過程中具有重要功能。本實(shí)驗(yàn)室將利用巴西橡膠樹HbNTL1基因的5'調(diào)控序列，通過酵母單雜交系統(tǒng)篩選調(diào)控HbNTL1轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)控因子，從而進(jìn)一步研究HbNTL1的表達(dá)調(diào)控及其在橡膠樹逆境脅迫中的作用。

4 結(jié)論

本研究利用Genome Walker 的方法克隆了巴西橡膠樹膜結(jié)合NAC轉(zhuǎn)錄因子HbNTL15'調(diào)控序列1 718 bp，軟件預(yù)測(cè)與分析該序列具有真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域和大量的順式作用元件，其中逆境脅迫相關(guān)元件占到50%，HbNTL1可能是一個(gè)逆境脅迫相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子，在橡膠樹抵抗逆境脅迫的生理過程中具有重要功能。

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