史馨怡 劉丹 陳黎黎 陳欣

（江蘇科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212018）

類胡蘿卜素（Carotenoids）是一類呈黃色、橙紅色或紅色的多烯類化合物，主要包括β-類胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素和蕃茄紅素等［1-3]。類胡蘿卜素廣泛存在于細(xì)菌、藻類、真菌和植物中，具有重要的生理保健功能，如吸收光能、保護(hù)光合作用系統(tǒng)、屏障紫外線、清除自由基以及穩(wěn)定色素蛋白的功能構(gòu)型等［1-4]。

國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株主要有三孢布拉氏霉（Blakesle a trispora）和紅酵母（Rhodotorulasp.）。三孢布拉氏霉發(fā)酵產(chǎn)率雖然較高，但存在發(fā)酵技術(shù)工藝復(fù)雜、發(fā)酵周期長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)；而紅酵母生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)單，發(fā)酵工藝易于調(diào)控，培養(yǎng)周期短，菌體可綜合利用，且屬于我國(guó)飼料行業(yè)12種確認(rèn)的飼用微生物，發(fā)酵過程易于產(chǎn)業(yè)化，因而具有較高的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景［1]。目前對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究主要集中在對(duì)菌株篩選、培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化以及類胡蘿卜素的分離提取等方面［1，5-7]，菌體中類胡蘿卜素含量可達(dá)到35 mg/g DCW［8]，發(fā)酵的最高產(chǎn)量也已超過100 mg/L［7]。近年來利用代謝工程改造菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的報(bào)道也逐漸增多，而利用逆境條件增加類胡蘿卜素發(fā)酵的研究較為少見。研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞中類胡蘿卜素的含量會(huì)受到培養(yǎng)環(huán)境的影響，南極嗜冷菌在5℃培養(yǎng)時(shí)類胡蘿卜素含量比在25℃培養(yǎng)時(shí)有明顯增加［10，11]，這是因?yàn)樵诘蜏丨h(huán)境中，類胡蘿卜素與膜結(jié)合可以增加膜的流動(dòng)性［2，12，13]；在酸處理?xiàng)l件下，酵母細(xì)胞利用胞內(nèi)大量的氨基酸合成脅迫響應(yīng)蛋白，造成胞內(nèi)氨基酸匱乏，而胞內(nèi)氨基酸的匱乏會(huì)引起胞內(nèi)氧自由基的積累［14]，酵母細(xì)胞能通過增加類胡蘿卜素的合成來消除胞內(nèi)氧自由基［2，15]；細(xì)胞中的類胡蘿卜素還能清除活性氧（Reactive oxygen species，ROS）或通過與其他抗氧化劑如維生素E或維生素C的協(xié)同作用，增加其在干旱、高鹽等環(huán)境中的抗逆性［16]。

本文研究了低溫、低溫處理時(shí)間、酸處理和高鹽處理及其交互作用對(duì)一株紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素影響，旨在為紅酵母對(duì)低溫、高鹽和酸處理的生理應(yīng)答機(jī)制的解析提供理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)利用紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素也具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 紅酵母（Rhodotorulasp.），江蘇科技大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保存。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏：分析純，均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 SW-C-J-1F超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；310P-03精密臺(tái)式pH計(jì)（上海杰晟科學(xué)儀器有限公司）；YXQ-SC41-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海核子儀器廠）；UV-9100紫外/可見光分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；202-00干燥箱（北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）；FLY-211B臥式大容量全溫培養(yǎng)振蕩器（上海申賢恒溫設(shè)備廠）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g/L）：YEPD培養(yǎng)基，酵母膏 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，瓊脂粉 2%（W/V），pH自然，121℃，15 min滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：同斜面培養(yǎng)基。

1.2.2 不同逆境條件處理方法 在500 mL的三角瓶中配制發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶裝液量為100 mL，用接種環(huán)接入斜面培養(yǎng)基活化的紅酵母菌株1環(huán)，于30℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)。對(duì)低溫（15℃）處理不同時(shí)間的試驗(yàn)開始于（120-t）h，其他試驗(yàn)于培養(yǎng)菌濃度至OD600nm=2.0時(shí)進(jìn)行。分別考察不同低溫（控制T=5、10、15、20、25、30℃直至發(fā)酵結(jié)束）、低溫（15℃）處理不同時(shí)間（t=12、24、36、48、60、72 h）、高鹽處理（一次性加入滅菌的NaCl使其在發(fā)酵液中的濃度分別為1、2、3、4、5 mol/L），以及酸處理（一次性加入2 mol/L的HCl溶液，使發(fā)酵液pH分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）對(duì)發(fā)酵的影響。發(fā)酵至120 h結(jié)束，進(jìn)行類胡蘿卜素含量及生物量（DCW）的測(cè)定，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以不接菌發(fā)酵液為空白對(duì)照。

1.2.3 不同逆境條件處理對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響 選擇低溫（T）、低溫處理時(shí)間（t）、高鹽和酸處理4種因素進(jìn)行研究，每個(gè)因素3個(gè)水平（表1），確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量，以類胡蘿卜素產(chǎn)量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析（Response surface analysis，RSA）考察4種逆境條件之間的交互作用。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.2.4 檢測(cè)方法 將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，菌體用無菌水洗后再離心，65℃左右烘干至恒重計(jì)算DCW。

類胡蘿卜素含量檢測(cè)方法及產(chǎn)量計(jì)算方法參照文獻(xiàn)［1] 進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取菌體0.1 g和石英砂0.05 g，充分研磨，加入6 mL丙酮：石油醚=11（VV）的混合液，28℃振蕩浸提30 min，然后8 000 r/min離心15 min，上清液即為胡蘿卜素浸提液。

類胡蘿卜素含量（μg/g干基）=（Aλmax×D×V）/（0.16×W）

式中：Aλmax為類胡蘿卜素浸提液最大波長(zhǎng)處的吸光度；D為色素浸提液稀釋倍數(shù)；V為浸提所用丙酮和石油醚的總體積（mL）；W為提取所用的發(fā)酵培養(yǎng)物重量（g）；0.16為胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。

類胡蘿卜素產(chǎn)量計(jì)算方法參照公式：

類胡蘿卜素產(chǎn)量（mg/L）=生物量×類胡蘿卜素含量

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖1可以看出，隨著溫度（T）的增加，生物量（DCW）逐漸增加，當(dāng)T為30℃時(shí)，DCW達(dá)到最高值17.46 g/L，說明T升高能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，低溫不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。由于類胡蘿卜素對(duì)微生物膜流動(dòng)性的調(diào)節(jié)具有重要，所以低溫能增加細(xì)胞類胡蘿卜素含量，類胡蘿卜素含量隨著T的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在T為15℃時(shí)，類胡蘿卜素含量達(dá)到最高值1.31 mg/g DCW。類胡蘿卜素產(chǎn)量與DCW和類胡蘿卜素含量都相關(guān)，溫度高能增加DCW，但類胡蘿卜素含量較低，而溫度低時(shí)DCW較低，但類胡蘿卜素含量高。隨著T的增加，類胡蘿卜素產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在T為15℃時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最高值19.07 mg/L。

2.2 處理時(shí)間對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖2可以看出，隨著低溫處理時(shí)間（t）的增加，DCW逐漸降低，當(dāng)t為72 h時(shí)，DCW達(dá)到最低值13.09 g/L，而t為12 h時(shí)，DCW的最高值17.18 g/L，說明t值越大對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響越大，低溫處理不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。類胡蘿卜素含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后略有下降的趨勢(shì)，在t為48 h時(shí)，類胡蘿卜素含量達(dá)到最高值1.35 mg/g DCW；繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間，可能由于類胡蘿卜素合成途經(jīng)相關(guān)的酶活性受到影響因而類胡蘿卜素含量出現(xiàn)了下降。由于類胡蘿卜素產(chǎn)量受到DCW和類胡蘿卜素含量的影響，延長(zhǎng)t能增加類胡蘿卜素含量，但DCW降低，而減少t時(shí)DCW增加，但類胡蘿卜素含量降低，隨著t的增加，類胡蘿卜素產(chǎn)量亦呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在t為48 h時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最高值18.95 mg/L。

2.3 酸處理對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖3可以看出，隨著pH的增加，DCW逐漸增加，當(dāng)pH為2.0時(shí)，DCW僅為6.22 g/L，當(dāng)pH為4.5時(shí)，DCW達(dá)到最高值17.12 g/L，說明酸處理對(duì)菌體生長(zhǎng)不利，pH較低不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于酸處理?xiàng)l件下紅酵母細(xì)胞會(huì)增加類胡蘿卜素的合成來替代SOD行使抗氧化功能而保護(hù)細(xì)胞，所以當(dāng)pH降低時(shí)紅酵母的類胡蘿卜素含量將增加，類胡蘿卜素含量隨著pH的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在pH為3.5時(shí)，類胡蘿卜素含量達(dá)到最高值1.27 mg/g DCW；pH較低時(shí)，可能由于類胡蘿卜素合成途經(jīng)相關(guān)的酶活性受到影響因而類胡蘿卜素含量出現(xiàn)了下降。隨著pH的增加，類胡蘿卜素產(chǎn)量亦呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在pH為3.5時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最高值19.79 mg/L。

2.4 高鹽處理對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖4可以看出，隨著NaCl濃度（CNacl）的增加，DCW呈現(xiàn)先略有上升后明顯下降的趨勢(shì)，當(dāng)CNaCl為1.0 mol/L時(shí)，DCW達(dá)到最高值17.46 g/L，而CNaCl為5.0 mol/L時(shí)，DCW僅為4.46 g/L，說明CNaCl的增加能提供細(xì)胞生長(zhǎng)需要的無機(jī)鹽而增加DCW，但過高的CNaCl造成較高的滲透壓影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于紅酵母在高鹽的條件下會(huì)增加類胡蘿卜素的合成，所以增加CNaCl能增加細(xì)胞類胡蘿卜素含量，但過高的CNaCl可能通過影響類胡蘿卜素合成途經(jīng)相關(guān)的酶活性而使類胡蘿卜素合成受到影響，所以過高的CNaCl也不利于類胡蘿卜素含量的增加。類胡蘿卜素含量隨著CNaCl的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在CNaCl為2.0 mol/L時(shí)，類胡蘿卜素含量達(dá)到最高值1.24 mg/g DCW；CNaCl繼續(xù)升高為5.0 mol/L時(shí)，類胡蘿卜素含量降低到最低值0.98 mg/g DCW。由于類胡蘿卜素產(chǎn)量受到DCW和類胡蘿卜素含量的影響，隨著CNaCl的增加，類胡蘿卜素產(chǎn)量亦呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在CNaCl為2 mol/L時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最高值19.86 mg/L。

2.5 不同逆境條件處理對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

根據(jù)Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)的4因素3水平實(shí)驗(yàn)方案，并以變量X1、X2、X3和X4分別代表T、t、pH及CNaCl，結(jié)果見表2。

通過Design Expert 7.0軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型：Y=27.02-0.52X1-0.021X2+0.52X3+0.49X4-0.11X1X2+0.77X1X3-0.82X1X4-0.83X2X3+0.057X2X4+0.10X3X4-5.76X12-4.47X22-3.18X32-2.21X42，其決定系數(shù)R2= 0.9845，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值非常接近。方差分析表明，以上回歸方程較好地?cái)M合了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

由方差分析結(jié)果（表3）可知，上述回歸方程描述了各因子與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著性，由F值檢驗(yàn)來判定，概率P值越小，則其相應(yīng)變量的顯著性越高。T，pH、CNaCl的影響以及T-pH、T-CNaCl和t-pH的交互作用對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響均顯著（P>F值分別為0.011 8，0.011 8，0.015 8，0.025 3，0.018 8，0.017 1）。t，T-T，t-CNaCl，pHCNaCl對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響不顯著（P>F值分別為0.908 6、0.726 8，0.854 9和0.738 7）。Model的P>F值<0.000 1，表明該二次方程模型達(dá)到極顯著水平，失擬相=1.06>0.05，表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著，說明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。相關(guān)系數(shù)r=338.30/343.63×l00%=98.45%，說明響應(yīng)值的變化有98.45%來源于所選變量，可以用此模型對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量進(jìn)行分析。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子X1、X2、X3、X4。所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。本試驗(yàn)根據(jù)回歸方程進(jìn)行不同因子的響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖5示。從圖5可以看出，在t為48 h，CNaCl為2.0 mol/L時(shí)，T與pH的交互作用對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量影響顯著，T與pH的提高可以增加類胡蘿卜素產(chǎn)量，但T要隨著pH的變化而有所變化，因?yàn)檫^高的處理溫度會(huì)影響類胡蘿卜素含量，過低的pH也會(huì)影響DCW，從而影響類胡蘿卜素產(chǎn)量。

在t為48 h，pH為3.5時(shí)，T與CNaCl的交互作用對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量影響顯著，T與CNaCl的提高可以增加類胡蘿卜素產(chǎn)量。但T要隨著CNaCl的變化而有所變化，因?yàn)檫^高的處理溫度會(huì)影響類胡蘿卜素含量，過高的CNaCl也會(huì)影響DCW從而影響類胡蘿卜素產(chǎn)量。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

在T為15℃，CNaCl為2.0 mol/L時(shí)，t與pH的交互作用對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量影響顯著，t與pH的提高可以增加類胡蘿卜素產(chǎn)量，但t要隨著pH的變化而有所變化，因?yàn)閠的增加以及過低的pH會(huì)影響DCW，過高的pH也會(huì)影響類胡蘿卜素含量從而影響類胡蘿卜素產(chǎn)量。

利用Design-Expert 7.0計(jì)算得到類胡蘿卜素發(fā)酵的最佳條件為：T=14.76℃，t=47.91 h，pH=3.54，CNaCl=2.12 mol/L，類胡蘿卜素產(chǎn)量的理論最高值為27.08 mg/L。在該條件下重新進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到類胡蘿卜素產(chǎn)量為（31.04±0.89）mg/L，高于試驗(yàn)中的最高值28.10 mg/L，說明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的類胡蘿卜素發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 討論

類胡蘿卜素廣泛存在于細(xì)菌、藻類、真菌和植物中，具有重要的生理保健功能。由于動(dòng)物及人體自身無法合成類胡蘿卜素，因而常被作為飼料、保健食品的添加劑。目前，通過大面積養(yǎng)殖鹽藻獲得類胡蘿卜素的方法最為成熟，但鹽藻的養(yǎng)殖對(duì)培養(yǎng)條件要求較高。利用紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素具有安全、成本低等優(yōu)點(diǎn)因而備受關(guān)注。在前期的研究中，經(jīng)過對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化，該菌株類胡蘿卜素含量達(dá)到0.52 mg/g DCW，發(fā)酵最高產(chǎn)量達(dá)到11.61 mg/L［1]。由于低溫、高鹽度、酸處理等逆境有利于類胡蘿卜素的合成，為了進(jìn)一步提高類胡蘿卜素產(chǎn)量，考察了低溫、低溫處理時(shí)間、酸處理及高鹽處理對(duì)該菌株發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響。在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到31.04 mg/L，較不利用逆境條件處理時(shí)（11.61 mg/L）提高了2.67倍，類胡蘿卜素含量也顯著提高。目前國(guó)內(nèi)利用紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素報(bào)道的產(chǎn)量大多較低（6-30 mg/L），菌體中類胡蘿卜素含量也不高（一般低于1.0 mg/g DCW）［5，6]，而利用逆境培養(yǎng)條件增加類胡蘿卜素發(fā)酵的研究較為少見，通過將菌體在逆境條件下培養(yǎng)，類胡蘿卜素含量和產(chǎn)量均明顯提高，若在此基礎(chǔ)上利用流加及高密度發(fā)酵等策略進(jìn)一步增加類胡蘿卜素的產(chǎn)量，將有望達(dá)到或超過國(guó)外類胡蘿卜素發(fā)酵的最高水平。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

4 結(jié)論

本研究考察了低溫、低溫處理時(shí)間、酸處理及高鹽處理對(duì)一株紅酵母（Rhodotorulasp.）發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響，在此基礎(chǔ)上并利用響應(yīng)面分析方法研究了其交互作用。結(jié)果表明，在溫度為15℃條件下處理48 h，pH3.5，NaCl濃度為2 mol/L的條件下，類胡蘿卜素最高產(chǎn)量達(dá)到31.04 mg/L，說明逆境對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素具有促進(jìn)作用。

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