夏靜芬，張仕榜，金婷婷，汪財(cái)生

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100)

鄰苯二甲酸酯類(Phthalate esters，PAEs)又稱酞酸酯，主要作為增塑劑被廣泛應(yīng)用于塑料工業(yè)中。但它與聚烯烴類塑料分子之間并不是以化學(xué)鍵結(jié)合，而是由氫鍵或范德華力連接，彼此保持各自獨(dú)立的化學(xué)性質(zhì)，因此，很容易從塑料中溶出和蒸發(fā)，從而轉(zhuǎn)入空氣、水體、底質(zhì)和生物等環(huán)境載體中，且持久存在而不易分解。近年來的研究表明PAEs是一類環(huán)境激素類物質(zhì)，可干擾人體激素的分泌，具有一般毒性和致畸、致突變性［1－2］。鑒于 PAEs毒性和普遍性，建立快速準(zhǔn)確檢測樣品中PAEs含量的方法已成為研究的熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)外測定PAEs的主要方法有氣相色譜法［3－4］、氣質(zhì)聯(lián)用法［5－6］、高效液相色譜法［7－8］以及表面增強(qiáng)拉曼光譜［9］等。熒光光譜法測定PAEs則少有報(bào)道，且多數(shù)工作集中在單因素優(yōu)化方面［10－11］，而在 PAEs 的熒光反應(yīng)過程中各因素往往是相互影響的。響應(yīng)面法基于非線性模式進(jìn)行設(shè)計(jì)和研究，將體系的響應(yīng)作為多個(gè)因素的函數(shù)，并運(yùn)用圖形和建模技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，具有精度高、預(yù)測性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于同時(shí)存在多因素影響的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化等方面，但在熒光法測定PAEs總量的優(yōu)化研究方面還未見報(bào)道。貝類屬于濾食性生物，移動性較差，生活方式固定，當(dāng)水環(huán)境受到污染后，在濾食餌料時(shí)不可避免地從水中吸入鄰苯二甲酸酯等有害物質(zhì)。本文以螺螄為研究對象，并通過響應(yīng)面法對影響熒光法測定PAEs的因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評價(jià)，這對于開展貝類生物體中PAEs安全檢測工作具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺螄樣品 于2011年11月至12月購于寧波各大菜場;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鄰苯二甲酸二甲酯(DMP，99%)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP，99%)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP，99.5%)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP，98%)、鄰苯二甲酸(2－乙基己基)酯(DEHP，99%)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP，99%) 均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;正己烷、二氯甲烷、甲醇 色譜純;蒸餾水二次重蒸水;其他試劑 均為市售分析純。

F－4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;pHS23TC精密數(shù)顯酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司;KL512數(shù)控恒溫水浴氮吹儀 北京康林科技有限責(zé)任公司;KS－1000T超聲波清洗機(jī) 寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集及處理 將螺絲去殼后，準(zhǔn)確稱取5.0g左右螺絲肉，用生理鹽水清洗，置于高速組織搗碎機(jī)中搗碎，并移入50mL不銹鋼離心管中，于4℃，8000r/min條件下離心10min。棄清液，同法2次，濾渣加入8mL 1∶1的正己烷和二氯甲烷混合液，置于1000W的超聲波清洗機(jī)中超聲提取30min，而后在4℃，160r/min條件下?lián)u床振蕩1h。取出后，在4℃，8000r/min條件下離心10min，重復(fù)萃取三次。取上清液置于比色管中，經(jīng)氮吹至干。加入2mL甲醇，在小型超聲提取儀中超聲溶解0.5h，經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過濾后待測。按上述操作步驟同時(shí)用蒸餾水制備空白樣品。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 分別以NaOH溶液濃度(1.0、2.5、5.0、7.5、10mol/L)，Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液 pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，5.7 ×10－3mol/L 的 EDTA－Fe(Ⅱ)(0.1、0.3、0.5、0.7、1mL)和 3% 的 H2O2(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL)用量為單因素，考查 4 個(gè)因素對熒光反應(yīng)強(qiáng)度的影響。熒光法反應(yīng)操作流程如下:取0.2mL的鄰苯二甲酸酯工作液于20mL比色管中，加入0.5mL一定濃度的NaOH溶液，稀釋至10mL，70℃水浴加熱15min后取出，冷卻至室溫，加1∶1 HCl調(diào)至中性，依次加入7mL緩沖溶液，EDTA－Fe(Ⅱ)溶液，H2O2溶液，定容至20mL，室溫反應(yīng)2h(從加入EDTA－Fe(Ⅱ)溶液搖勻后計(jì)時(shí))后，測定體系的熒光強(qiáng)度。同時(shí)以0.2mL的甲醇為空白對照。后續(xù)因素的實(shí)驗(yàn)將前一因素的較佳條件代入以置換初始條件。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化熒光反應(yīng)條件 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定Box－behnken設(shè)計(jì)的自變量，以熒光強(qiáng)度為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面優(yōu)化熒光反應(yīng)條件，設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 設(shè)計(jì)因素及水平表Table1 Levels and factors in Box－Benhnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物的最佳檢測波長

鄰苯二甲酸酯在堿性條件下水解生成鄰苯二甲酸鈉，鄰苯二甲酸鈉在Fe(Ⅱ)和H2O2作用下生成具有熒光的羥基鄰苯二甲酸鈉。按1.2.2的方法分別對DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP 和 DOP 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光激發(fā)和發(fā)射掃描，掃描結(jié)果表明:不同類型的鄰苯二甲酸酯水解后的反應(yīng)產(chǎn)物的λex和λem非常接近，最大激發(fā)波長300nm，最大發(fā)射波長410nm。

2.2 熒光反應(yīng)單因素影響研究

色譜分析表明螺類樣品體內(nèi)DBP含量較高［12］，本實(shí)驗(yàn)即以DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液為例進(jìn)行單因素優(yōu)化和響應(yīng)面模型預(yù)測的研究。PAEs熒光反應(yīng)包括酯水解生成鄰苯二甲酸鈉和水解產(chǎn)物通過Fenton反應(yīng)生成具有熒光的羥基鄰苯二甲酸鈉兩個(gè)過程，水解過程中NaOH溶液的濃度，F(xiàn)enton反應(yīng)緩沖溶液的pH，EDTA－Fe(Ⅱ)和H2O2用量是影響產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的最主要因素。實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度為指標(biāo)，考查了這四個(gè)因素的影響。

2.2.1 NaOH溶液的濃度的影響 結(jié)果見圖1。從圖1可知，在控制緩沖液pH為7.0，EDTA－Fe(Ⅱ)和H2O2用量分別為0.5、1.5mL的條件下，隨著NaOH溶液濃度升高，反應(yīng)物熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，當(dāng)NaOH溶液的濃度為5.0mol/L時(shí)，鄰苯二甲酸酯水解最完全，熒光強(qiáng)度最高，繼續(xù)升高 NaOH濃度，熒光強(qiáng)度反而下降。

圖1 NaOH溶液的濃度對熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on fluorescence intensity

2.2.2 Fenton反應(yīng)緩沖溶液的pH的影響 結(jié)果見圖2。不同pH的緩沖溶液對反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度影響結(jié)果表明，當(dāng)pH接近中性條件時(shí)，熒光強(qiáng)度大且穩(wěn)定;pH低于7時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯減弱;隨著pH的升高，F(xiàn)e(Ⅱ)生成沉淀，熒光值也出現(xiàn)下降趨勢。

2.2.3 EDTA－Fe(Ⅱ)濃度的影響 EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的用量對反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度影響見圖3，由圖3可以看出隨著EDTA－Fe(Ⅱ)溶液用量增加，反應(yīng)后產(chǎn)物熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，當(dāng)加入0.5mL 5.7×10－3mol/L的EDTA－Fe(Ⅱ)溶液時(shí)，產(chǎn)物熒光響應(yīng)值最高，之后有所下降趨勢。

2.2.4 H2O2用量的影響 結(jié)果見圖4。不同H2O2量對反應(yīng)體系產(chǎn)生熒光強(qiáng)度影響與EDTA－Fe(Ⅱ)不同，一開始熒光反應(yīng)強(qiáng)度隨H2O2用量的增大而增大;當(dāng)H2O2的用量大于1.0～1.5mL后，熒光值穩(wěn)定;繼續(xù)增加H2O2用量，熒光值基本不變。

圖2 緩沖溶液的pH對熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of pH on fluorescence intensity

圖3 EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的用量對熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of EDTA－Fe(Ⅱ)volume on fluorescence intensity

圖4 H2O2用量對熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of H2O2volumes on fluorescence intensity

2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化反應(yīng)條件

為探索熒光反應(yīng)體系中各條件間的交互作用，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)曲面分析法研究NaOH溶液濃度，緩沖液pH，EDTA－Fe(Ⅱ)和 H2O2用量4因素對PAEs在Fenton反應(yīng)體系中產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)以反應(yīng)體系產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度為響應(yīng)值進(jìn)行Box－Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

采用design expert7.0軟件對表2的熒光強(qiáng)度和影響因素進(jìn)行多元回歸擬合，得到熒光強(qiáng)度對自變量A、B、C、D的二次多項(xiàng)回歸方程:

對模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表2 熒光強(qiáng)度響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and experimental results of RSM

從響應(yīng)面模型方差分析表可知，模型F值為23.35，概率p＜0.0001，表明模型極顯著;失擬項(xiàng)p=0.1544＞0.05，表明由誤差引起的失擬不顯著;模型的確定系數(shù)值為0.95894，調(diào)整校正確定系數(shù)為0.91788，兩者具有一致性，說明方程的因變量與全體自變量間線性關(guān)系明顯;模型的變異系數(shù)值為8.10%，說明模型的精密度較好。

回歸模型各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還表明，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序?yàn)?D＞C＞B＞A，即H2O2用量＞EDTA－Fe(Ⅱ)用量＞緩沖溶液的pH＞NaOH溶液的濃度，其中B、C、D均為高度顯著項(xiàng)，A為顯著項(xiàng)。交互項(xiàng)BC影響高度顯著，其三維響應(yīng)面圖見圖5，圖中橫坐標(biāo)分別為Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液的 pH與 EDTA－Fe(Ⅱ)溶液加入量兩個(gè)變量，3%的H2O2加入量及NaOH溶液的濃度變量已處于反應(yīng)體系產(chǎn)生熒光強(qiáng)度為最高值時(shí)的值。BC影響極顯著BD、CD影響顯著，AB、AC、AD 影響不顯著;在二次項(xiàng)中 A2、B2、C2和 D2的 p值均小于0.01，表明所有二次項(xiàng)差異高度顯著。二次回歸模型計(jì)算結(jié)果表明:在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的變量范圍內(nèi)，鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)熒光反應(yīng)體系產(chǎn)生最高熒光強(qiáng)度值162.3，此時(shí)最優(yōu)化的各項(xiàng)目變量分別為:加入 0.5mL NaOH溶液的濃度為 4.61mol/L、Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液的 pH為 7.09、5.7×10－3mol/L EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的加入量為 0.55mL、3%的H2O2需加入1.63mL。依此體系反復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測得平均熒光強(qiáng)度為164.50，與模型預(yù)測值非常接近，誤差為1.36%，充分反映曲面模型有效及具有強(qiáng)大的分析能力，可為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo)。

表3 響應(yīng)曲面二次模型的方差分析Table3 Analysis of variance for peak areas with various extraction conditions

圖5 EDTA－Fe(II)用量及緩沖液的pH交互作用對反應(yīng)體系的熒光值影響的3D曲面圖Fig.5 3D contour map of the influence of EDTA－Fe(II)volume and pH on fluorescence intensity

2.4 分析方法特性

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在選定的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，以不同濃度的DBP標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)(C，10－5mol/L)，熒光值為縱坐標(biāo)(F)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，DBP濃度與熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系?；貧w方程為F=1.9935C+2.6809，相關(guān)系數(shù)r為0.9943。

2.4.2 加和性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分別稱取表4所列6種PAEs酯，用甲醇定容至25mL，并同法稱取各酯類混合物用甲醇定容至25mL進(jìn)行加和性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示，實(shí)驗(yàn)的六種PAEs混合后濃度的測得值幾乎與其累加值相同，說明不同 PAEs的熒光值可以累加。

表4 加和性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of spectral additive property

2.4.3 回收率實(shí)驗(yàn) 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，測得對照樣品濃度的平均值為31.23×10－5mol/L。回收率范圍為93.80%～106.11%，表明該方法適用于貝類樣品鄰苯二甲酸酯類的測定。

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of recovery

表6 寧波市區(qū)菜市場螺螄體內(nèi)PAEs總量Table6 Analytical results of total PAEs in snails

2.5 樣品分析結(jié)果

采集寧波各區(qū)內(nèi)不同菜場的螺螄，按照1.2.1方法處理后，用優(yōu)化的熒光分析條件平行測定三次，結(jié)果見表6。由表6可知，樣品測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.73%～6.56%。寧波不同地區(qū)菜市場中螺螄PAEs的總量在26.64～44.89mg/kg之間，表明其受到了不同程度的鄰苯二甲酸酯類的污染，分別采集的14個(gè)市場螺螄樣品間存在著差異性較大，間接表明螄螺樣品養(yǎng)殖水域中PAEs污染程度。

3 結(jié)論

通過單因素法與響應(yīng)面法相結(jié)合的方法較快速、有效地得到最佳熒光反應(yīng)條件為NaOH濃度4.61mol/L，Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液的 pH7.09，5.7×10－3mol/L EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的加入量0.55mL，3%的H2O2加入量1.63mL。在優(yōu)化條件下測定螺螄樣品PAEs總量，方法的回收率在93.80%～106.11%之間，在測定寧波市區(qū)菜市場螺螄體內(nèi)PAES總量時(shí)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.73%～6.56%，所檢測螺螄中PAEs達(dá)26.64～44.89mg/kg。本實(shí)驗(yàn)研究有助于建立快速檢測螺螄等貝類生物體內(nèi)鄰苯二甲酸總量的方法。

［1］王小逸，林興桃，客慧明，等.鄰苯二甲酸酯類環(huán)境污染物健康危害研究新進(jìn)展［J］.環(huán)境與健康雜志，2007，24(9):736－738.

［2］胡雄星，韓中豪，劉必寅，等.鄰苯二甲酸酯的毒性及其在環(huán)境中的分布［J］.環(huán)境科學(xué)與管理，2007，32(1):37－40.

［3］陳海東，鮮放鳴，鄒惠仙，等.超聲萃取氣相色譜法測定植物樣中鄰苯二甲酸酯［J］.環(huán)境化學(xué)，2006，25(2):228－231.

［4］黃衛(wèi)紅，楊嵐欽，黃婷婷，等.超聲微波協(xié)同萃取－氣相色譜法測定土壤中鄰苯二甲酸酯類化合物［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(3):305－309.

［5］譚君，林竹光.GC－EI－MS內(nèi)標(biāo)法分析魚肉中鄰苯二甲酸酯［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2007，65(24):2875－2882.

［6］夏靜芬，邴哲希，梅春玲.響應(yīng)面法優(yōu)化固相微萃取飲用水中的 DBP［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34(11):142－146.

［7］林興桃，王小逸，夏定國，等.固相萃?。咝б合嗌V法測定人體尿液中鄰苯二甲酸酯及其代謝物［J］.分析化學(xué)，2011，39(6):877－881.

［8］李擁軍，熊文明，陳堅(jiān)文，等.固相萃取/高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定羅非魚中9種鄰苯二甲酸酯［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2012，3(31):278－283.

［9］紀(jì)麗君，謝云飛，姚衛(wèi)蓉.基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的塑料增塑劑鄰苯二甲酸酯定性篩查技術(shù)研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(15):297－300.

［10］李滿秀，王華燕.熒光法測定環(huán)境樣品中的鄰苯二甲酸酯［J］.分析化學(xué)，2005，33(9):1315－1317.

［11］李滿秀，李桂琴.催化動力學(xué)熒光法測定日化品中的鄰苯二甲酸酯［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2007，19(2):227－229.

［12］張?zhí)N暉，陳秉衡，鄭力行，等.環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸醋類物質(zhì)的測定與分析［J］.環(huán)境與健康雜志，2003，20(9):283－285.