萬宇平 ，唐承明 ，羅曉琴 ，馮才偉 ，崔艷莉

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.廣西壯族自治區(qū)獸藥監(jiān)察所，廣西 南寧 530000）

β-內(nèi)酰胺類抗生素（β-lactams）是化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括臨床最常用的青霉素與頭孢菌素，以及新發(fā)展的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等其他非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素。此類抗生素具有殺菌活性強(qiáng)、毒副作用小等特點(diǎn)。

長期以來，β-內(nèi)酰胺類抗生素被廣泛地應(yīng)用于人和動物疾病的防治，尤其是在治療牛乳房炎方面具有顯著療效。但抗生素通過乳牛機(jī)體的血液在一定時間內(nèi)殘留于生牛奶中，如果不正當(dāng)使用或者沒有遵守奶牛停藥期規(guī)定，將會造成抗生素在乳制品中的殘留，如若經(jīng)常飲用含有抗生素殘留的牛奶，相當(dāng)于長期間接地吸收低劑量的抗生素，致使人體內(nèi)病原菌對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，從而造成免疫力降低。

因此，我們有必要建立一類準(zhǔn)確、快速、簡便的β-內(nèi)酰胺類抗生素檢測方法，以保障人類健康和維護(hù)正常的進(jìn)出口貿(mào)易。由于試紙條法具有靈敏度高、檢測時間短、準(zhǔn)確度高、易貯存、攜帶方便、可進(jìn)行現(xiàn)場操作等特點(diǎn)，因而成為牛奶中違禁抗生素篩查時的首選產(chǎn)品。本文主要研究了β-內(nèi)酰胺類抗生素中常見的幾種藥物如青霉素G、氨芐青霉素、阿莫西林、苯唑青霉素、鄰青霉素、雙青霉素、萘夫西林、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻呋、頭孢洛寧和頭孢喹肟的試紙條分析檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 牛奶樣品購自市場；β-內(nèi)酰胺類各種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；β-內(nèi)酰胺類抗生素快速檢測試紙條購自北京某生物技術(shù)有限公司；微量移液器購自美國Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試樣制備 陰性牛奶樣品：取空白牛奶樣品任1份5mL，置于50mL塑料瓶中，再分別加入適量β-內(nèi)酰胺類各種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度分別為0和β-內(nèi)酰胺類試紙條檢測限下限的1/2，混勻備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

陽性牛奶樣品：取空白牛奶樣品任1份5mL，置于50mL塑料瓶中，再分別加入適量β-內(nèi)酰胺類各種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度分別為β-內(nèi)酰胺類試紙條檢測限下限和檢測限下限的2倍，混勻備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 試紙條的使用步驟 用微量移液器吸取200μL待檢牛奶樣品溶液于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中的試劑混勻。將試紙條插入微孔中（印有“MAX”線的一端朝下），充分浸入溶液中。室溫（20～25℃）孵育5 min后，取出試紙條觀察顏色，判定結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判定 如果C線和T線都顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣品中β-內(nèi)酰胺類抗生素濃度低于檢測限，為陰性結(jié)果；如果C線顯色，T線不顯色，表示牛奶樣品中β-內(nèi)酰胺類抗生素濃度高于檢測限，為陽性結(jié)果；如果未出現(xiàn)C線，表明操作過程不正確或試紙條已變質(zhì)失效（如圖1）。

圖1 β-內(nèi)酰胺類抗生素快速檢測試紙條示意圖

1.2.4 檢測閾值的測定 用β-內(nèi)酰胺類試紙條分別對添加各種抗生素的陰性牛奶、陽性牛奶進(jìn)行檢測，每個樣品作2個重復(fù)，記錄每種抗生素呈現(xiàn)陽性的最低濃度值。如果檢測限下限濃度的陽性牛奶樣品不呈現(xiàn)陽性則根據(jù)檢測限（檢測限有下限和上限的，則在檢測限內(nèi)選擇更高的濃度進(jìn)行檢測）配制濃度更高的陽性牛奶樣品進(jìn)行檢測，直至出現(xiàn)陽性結(jié)果為止。

1.2.5 假陽性率的測定 取空白牛奶樣品50份，每份10 mL，按照1.2.1陰性牛奶樣品的制備方法，制備B1 B2、B3、……、B50等100份陰性牛奶樣品。對陰性牛奶樣品用試紙條檢測，每個樣品作2個重復(fù)，統(tǒng)計假陽性數(shù)，按照下面的公式計算假陽性率。

1.2.6 假陰性率的測定 取空白牛奶樣品50份，每份10 mL，按照1.2.1陽性牛奶樣品的制備方法，制備B1 B2、B3、……、B50等100份陽性牛奶樣品。對陽性牛奶樣品用試紙條檢測，每個樣品作2個重復(fù)，統(tǒng)計假陰性數(shù)，按照下面的公式計算假陰性率。

2 結(jié)果

用β-內(nèi)酰胺類試紙條對該類12種抗生素進(jìn)行了檢測限、假陽性率、假陰性率驗(yàn)證，結(jié)果如表1所示。

表1 試紙條檢測結(jié)果

3 討論

3.1 本試驗(yàn)的檢測閾值基本在檢測限范圍內(nèi)，因此可以判定，試紙條檢測限指標(biāo)合格。同時由于每一批次抗體存在質(zhì)量上的差異，所以在制定檢測限時，采用了以一個濃度范圍作為檢測限的方式。

3.2 檢測限即試紙條對樣品所能檢測出來的最低濃度值。當(dāng)檢測閾值與試紙條標(biāo)示的檢測限相符時，該試紙條為合格；當(dāng)其小于檢測限時，則會導(dǎo)致假陽性檢測結(jié)果的出現(xiàn)；當(dāng)其大于檢測限時，則會導(dǎo)致假陰性檢測結(jié)果的出現(xiàn)。目前，國內(nèi)外對于快速檢測技術(shù)的一個基本原則是：絕不能有假陰性，但允許有假陽性。按照農(nóng)業(yè)部獸藥殘留專家委員會“試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)”，快速檢測試紙條的假陽性率應(yīng)小于10%

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