呂 順，林 琳，向 蔚，陸劍鋒，葉應(yīng)旺，姜紹通

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

水解明膠是一種低分子質(zhì)量多肽，是以動(dòng)物結(jié)締組織中的膠原蛋白為原料，經(jīng)水解而制得的產(chǎn)品[1]。水解明膠除具有明膠所固有的絕大部分優(yōu)良理化性能外，經(jīng)水解后，相對(duì)分子質(zhì)量降低，在水中的溶解度增大，更易被人體吸收。明膠水解物除具有優(yōu)良的理化性能外，還具有多種生物活性，如魷魚皮[2-3]和河豚魚皮[4]明膠水解物及羅非魚骨明膠水解物[5]被發(fā)現(xiàn)具有清除自由基和抗氧化活性，鱈魚皮明膠[6]、海參明膠[7]和魷魚皮明膠[8]水解物被發(fā)現(xiàn)具有ACE抑制活性等。目前，水解明膠已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等方面[9]。

明膠水解的方法主要有酸法、堿法和酶法，其中使用較為廣泛的是酶法水解[10]。酶法水解明膠的過程中產(chǎn)生的污染物少，反應(yīng)條件溫和，生產(chǎn)過程中能耗少，產(chǎn)品性能穩(wěn)定質(zhì)量可靠，且整個(gè)生產(chǎn)過程易形成連續(xù)化生產(chǎn)，便于大批量生產(chǎn)。堿性蛋白酶[11]、木瓜蛋白酶[12]、復(fù)合蛋白酶[13]、胃蛋白酶[14]、Alcalase[15]等酶都被用于水解明膠或魚皮，生產(chǎn)水解明膠和多肽。

斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)是安徽乃至全國(guó)的主要淡水養(yǎng)殖、加工品種，主要用于生產(chǎn)出口鮰魚片，鮰魚片加工中產(chǎn)生40%左右的下腳料，主要是魚皮(10%)、魚骨、內(nèi)臟等，目前這部分副產(chǎn)物主要用來生產(chǎn)魚粉，其中的膠原蛋白/明膠資源被大大浪費(fèi)。從鮰魚皮中提取明膠、制備水解明膠，既可以減少加工廢棄物對(duì)環(huán)境的污染，又可增加其附加值。本實(shí)驗(yàn)以鮰魚皮明膠為原料，通過單因素和正交試驗(yàn)確定堿性蛋白酶水解明膠的最佳工藝條件，為水解明膠的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斑點(diǎn)叉尾鮰魚(Ictalurus punctatus)魚皮 安徽明光永言水產(chǎn)食品有限公司。

堿性蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器有限公司；FSH-ZA型可調(diào)高速勻漿機(jī) 江蘇省金壇市華榮儀器制造有限公司；HH-2孔數(shù)顯水浴鍋 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；SP-752紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；FD-1型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CT15RT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮰魚皮明膠的提取[16]

稱取一定量的鮰魚皮，剪成小塊，按1:6(m/V)加入0.05mol/L NaOH溶液浸泡30min，水洗至中性，按1:6再加0.2%硫酸溶液浸泡30min，水洗至中性，最后用熱水抽提過夜，4000r/min離心20min，棄去沉淀不溶物，得到粗膠制品，于冷凍干燥機(jī)中凍干。

1.3.2 鮰魚皮明膠水解工藝

稱取制備的明膠，用蒸餾水溶解制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的明膠溶液。采用堿性蛋白酶對(duì)明膠溶液進(jìn)行水解，水解過程中用電動(dòng)攪拌機(jī)不斷攪拌，水解結(jié)束后，將水解液置于沸水浴中煮沸10min以滅酶活，終止水解反應(yīng)，然后迅速冷卻至室溫。將水解液以4000r/min離心15min，棄去沉淀并記錄上清液體積。

1.3.3 明膠水解度的測(cè)定

采用紫外分光光度法[17]測(cè)定明膠水解度，并對(duì)此方法進(jìn)行改進(jìn)。

1.3.3.1 明膠溶液測(cè)試質(zhì)量濃度的確定

通過不同加酶量(0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0g/100mL)對(duì)明膠水解程度的影響實(shí)驗(yàn)，對(duì)明膠溶液的質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系進(jìn)行研究，確定明膠溶液的測(cè)試質(zhì)量濃度。具體操作為：在pH 10.0、10g/100mL的明膠溶液中，改變堿性蛋白酶加入量，并在溫度為50℃恒溫水浴鍋中，使明膠水解2h。反應(yīng)完成后，將明膠配成質(zhì)量濃度為10-2、10-3、10-4g/mL的測(cè)試液進(jìn)行測(cè)定，以確定測(cè)試液質(zhì)量濃度。

1.3.3.2 明膠水解液水解度與吸光度的線性相關(guān)性

取9支試管(含1mL pH10.0的明膠溶液)于50℃水浴鍋中預(yù)熱10min，各管中分別加入1mL 6000U/mL堿性蛋白酶酶液，在50℃條件下對(duì)明膠進(jìn)行水解，酶解時(shí)間分別為5、10、15、20、30、60、120、240、480min。水解完成后，于100℃煮沸5min滅酶活，4000r/min離心15min，棄去沉淀并記錄上清液體積。用蒸餾水將上清液定容到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度，在波長(zhǎng)為275nm處測(cè)定吸光度。吸光度測(cè)定完后，采用茚三酮法[18]測(cè)定水解液的水解度(DH)。水解度按公式(1)計(jì)算。

式中：h為水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)/(mmol/g)；htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)/(mmol/g)，明膠取8.41mmol/g。

以水解液的吸光度為橫坐標(biāo)，水解度為縱坐標(biāo)，繪制水解液吸光度和水解度的關(guān)系圖，確定線性方程和相關(guān)性以及適用的吸光度范圍。

1.3.4 明膠水解液氮回收率(NR)的測(cè)定

采用堿性蛋白酶對(duì)鮰魚皮明膠進(jìn)行水解后，記錄水解離心后上清液的總體積，取5mL水解液，用凱氏定氮法消化、定氮，測(cè)定上清液中蛋白含量，則氮回收率按式(2)計(jì)算。

1.3.5 明膠水解液平均分子質(zhì)量的測(cè)定[19]

將分子質(zhì)量已知的標(biāo)準(zhǔn)品K2CrO4(Mr=196)、還原型谷胱甘肽(Mr=307)、VB12(Mr=1355)、細(xì)胞色素C(Mr=12300)和胃蛋白酶(Mr＝35500)各10mg，分別溶于1mL洗脫磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L，pH7.0)中，配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取已處理好的交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex G-25)裝柱，并用洗脫液平衡。分別加入各標(biāo)準(zhǔn)品1mL，在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度，并記錄各標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)最大吸收峰時(shí)洗脫液的流出體積(mL)。

以標(biāo)準(zhǔn)品重鉻酸鉀、還原型谷胱甘肽、VB12、細(xì)胞色素C和胃蛋白酶洗脫體積(V)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lgMr)為橫坐標(biāo)，繪制分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算明膠水解液的平均分子質(zhì)量。

1.3.6 堿性蛋白酶水解明膠的最佳條件確定

選用堿性蛋白酶作為水解明膠用酶，對(duì)酶解溫度(35、40、45、50、55℃)、pH值(8.0、9.0、9.5、10.0、10.5)、酶解時(shí)間(1、2、3、4、5h)、加酶量(1000、2000、3000、4000、5000U/mL)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后采用四因素三水平正交試驗(yàn)確定堿性蛋白酶水解明膠的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠水解度測(cè)定方法的確定

分別測(cè)定質(zhì)量濃度為10-2、10-3、10-4g/mL的明膠溶液經(jīng)水解后在275nm波長(zhǎng)處的吸光度(A275nm)，以加酶量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制加酶量與明膠水解液吸光度之間的關(guān)系曲線。

從圖1可以看出，當(dāng)明膠溶液的質(zhì)量濃度為10-3g/mL時(shí)，明膠的水解度與吸光度(A275nm)之間的關(guān)系能正確地反映出明膠的水解反應(yīng)規(guī)律，其他兩種質(zhì)量濃度的測(cè)試結(jié)果都有明顯的誤差，難以判斷明膠的水解。因此，確定采用紫外分光光度法測(cè)定明膠溶液水解度的適宜質(zhì)量濃度為10-3g/mL。

圖1 酶用量與明膠溶液質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.1 Relationship between enzyme loading and gelatin concentration

取堿性蛋白酶，在其適宜作用條件下，對(duì)明膠溶液分別水解5、10、15、20、30、60、120、240、480min。水解完成后采用紫外分光光度法測(cè)定水解液的吸光度(A275nm)，并采用傳統(tǒng)水解度測(cè)定方法測(cè)定明膠的水解度，以吸光度(A275nm)為橫坐標(biāo)，以水解度為縱坐標(biāo)作圖。得到：當(dāng)吸光度在0.082～0.708的范圍內(nèi)時(shí)，水解液的吸光度與水解度成線性關(guān)系，其線性相關(guān)方程為：Y=49.39X－0.443(R2=0.996)，式中：Y為水解液的水解度/%；X為水解液在275nm波長(zhǎng)處的吸光度。

通過本實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，在明膠水解液的質(zhì)量濃度為10-3g/mL時(shí)，其水解度與吸光度(A275nm)呈線性相關(guān)。因此，可以測(cè)定明膠水解液的A275nm值，利用水解度與吸光度的線性關(guān)系方程，計(jì)算得到明膠水解液的水解度。

目前，測(cè)定蛋白質(zhì)水解度的方法主要有三硝基苯磺酸法(TNBS)、鄰苯二甲醛(OPA)法、茚三酮法、甲醛滴定法和pH-Stat法等。甲醛滴定法是國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用于測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度的方法，操作較簡(jiǎn)單，但脯氨酸與甲醛作用后，生成不穩(wěn)定化合物，因此采用甲醛滴定法測(cè)定富含脯氨酸的原料，其結(jié)果偏低[20]。明膠水解液中脯氨酸含量較高，因此甲醛滴定法不適用于測(cè)定明膠水解物的水解度。pH-Stat法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、快速、可重復(fù)性高，通常被用于水解度的連續(xù)測(cè)定。但這種方法僅適用于中性及堿性(pH＞7)或pH＜3的酸性溶液中進(jìn)行的水解，并且需要特別的儀器控制水解過程中的pH值，同時(shí)這種方法還需要用其他的方法進(jìn)行校正，有研究[21]表明pH-Stat法的測(cè)定結(jié)果偏高。TNBS法測(cè)定的結(jié)果較準(zhǔn)確，但其所用試劑不易獲得且測(cè)定過程耗時(shí)較長(zhǎng)，不適于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水解度[22]。OPA法操作簡(jiǎn)單，可快速測(cè)定水解度，但由于其需要采用熒光光度計(jì)測(cè)定，因此應(yīng)用受到一定的限制[23]。茚三酮比色法操作簡(jiǎn)單，測(cè)定快速，但是由于不同氨基酸和水合茚三酮顯色不同，對(duì)測(cè)量結(jié)果有部分偏差，使測(cè)定結(jié)果偏低[24]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)已有的利用紫外分光光度法測(cè)定明膠水解度的方法進(jìn)行了改進(jìn)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果較準(zhǔn)確，可快速測(cè)定明膠的水解度，不僅適用于實(shí)驗(yàn)室中對(duì)明膠水解液水解度的測(cè)定，也便于工廠化生產(chǎn)時(shí)監(jiān)控明膠水解度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此方法測(cè)定明膠水解液的水解度。

2.2 堿性蛋白酶水解明膠的最佳條件確定

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 酶解溫度對(duì)堿性蛋白酶水解明膠的影響

圖2 酶解溫度對(duì)堿性蛋白酶水解明膠的影響Fig.2 Effect of temperature on gelatin hydrolysis by alkaline protease

由圖2可知，堿性蛋白酶水解明膠的最適溫度為50℃，此時(shí)的水解度最高，為33.52%，當(dāng)酶解溫度達(dá)到55℃，可能是高溫引起堿性蛋白酶失活而使水解度有所降低。

2.2.1.2 pH值對(duì)堿性蛋白酶水解明膠的影響

圖3 pH值對(duì)堿性蛋白酶水解明膠的影響Fig.3 Effect of pH on gelatin hydrolysis by alkaline protease

由圖3可知，pH8時(shí)堿性蛋白酶對(duì)明膠的水解作用較弱，水解度較低，而當(dāng)pH值達(dá)到9.5時(shí)，堿性蛋白酶對(duì)明膠的水解作用最強(qiáng)。當(dāng)pH值繼續(xù)增大時(shí)，堿性蛋白酶對(duì)明膠的水解作用減弱。

2.2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶水解明膠的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶水解明膠的影響Fig.4 Effect of time on gelatin hydrolysis by alkaline protease

由圖4可知，水解初期(酶解時(shí)間為1h)，水解度增長(zhǎng)緩慢，而在酶解2～4h這段時(shí)間，水解度上升較快，因?yàn)閴A性蛋白酶需要在其最適溫度下活化一段時(shí)間，酶的活性中心方能被激活，達(dá)到其最佳水解效果。當(dāng)酶解時(shí)間為4h時(shí)，酶的水解作用最大，此時(shí)水解度達(dá)到最大值。酶解4h后，因?yàn)榈孜餄舛认陆?，可以與酶活性中心結(jié)合的底物減少，水解趨于平衡，水解度基本不增長(zhǎng)，此時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響不大。

2.2.1.4 加酶量對(duì)堿性蛋白酶水解明膠的影響

圖5 加酶量對(duì)堿性蛋白酶水解明膠的影響Fig.5 Effect of enzyme loading on gelatin hydrolysis by alkaline protease

由圖5可知，堿性蛋白酶的加入量會(huì)影響明膠的水解效果。當(dāng)加酶量較少時(shí)，堿性蛋白酶的水解效果不好；當(dāng)堿性蛋白酶的加入量為3000U/mL，水解效果最好，此后繼續(xù)增加加酶量，對(duì)水解度的影響不大。

2.2.2 堿性蛋白酶水解明膠的正交試驗(yàn)

表1 正交試驗(yàn)因素水平、結(jié)果及分析TTaabbllee 11 OOrrtthhooggoonnaall aarrrraayy ddeessiiggnn aarrrraannggeemmeenntt aanndd rreessuullttss

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素作用，以酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間和加酶量為主要因素，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用四因素三水平正交試驗(yàn)確定堿性蛋白酶的最佳水解條件。正交試驗(yàn)因素水平及試驗(yàn)結(jié)果、極差分析見表1。第6組試驗(yàn)得到水解液的水解度最高，即加酶量3000U/mL、酶解溫度50℃、pH10.0、酶解時(shí)間3h，此時(shí)水解度為34.79%。通過極差分析可知，影響堿性蛋白酶對(duì)明膠水解效果的主次因素為D＞A＞B＞C，即加酶量＞酶解溫度＞pH值＞酶解時(shí)間。根據(jù)極差分析結(jié)果可知堿性蛋白酶水解明膠的最佳工藝條件為A2B2C1D3，即加酶量4000U/mL、酶解溫度50℃、pH值為9.5、酶解時(shí)間3h，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，此條件下得到水解液的水解度為35.12%，較直觀分析第6組試驗(yàn)得到的水解液的水解度高出了0.33%。

在最佳工藝條件制備得到的明膠水解物的氮回收率為65.3%，產(chǎn)率為47.0%，經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾層析可知水解液的分子質(zhì)量分布是連續(xù)的，其平均分子質(zhì)量為5500D。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過以上工藝條件水解制得的明膠水解物的水解度較高，獲得的水解物分子質(zhì)量分布范圍較寬，可進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分離，獲得不同分子質(zhì)量的組分，以滿足不同的應(yīng)用要求。

3 結(jié) 論

3.1 采用改進(jìn)的紫外分光光度法測(cè)定明膠水解度，明膠水解液質(zhì)量濃度為10-3g/mL時(shí)，水解液的吸光度(A275nm)能正確地反映出明膠的水解反應(yīng)規(guī)律，吸光度(A275nm)在0.082～0.708范圍內(nèi)時(shí)，吸光度與水解度的線性相關(guān)方程為：Y=49.39X－0.443(R2=0.996)，通過此方程可根據(jù)水解液在275nm波長(zhǎng)處的吸光度計(jì)算水解度。此方法較傳統(tǒng)的水解度測(cè)定方法更為簡(jiǎn)單、快速。

3.2 選用堿性蛋白酶對(duì)明膠進(jìn)行水解，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定堿性蛋白酶水解明膠的最佳工藝條件。各因素對(duì)堿性蛋白酶水解明膠的影響作用不同，其中加酶量對(duì)水解度的影響最大，酶解溫度和pH值次之，酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響最小。堿性蛋白酶水解明膠的最優(yōu)工藝條件為加酶量4000U/mL、酶解溫度50℃、pH值為9.5、酶解時(shí)間3h，此時(shí)的水解度達(dá)到35.12%。

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