高 梅，朱春花，曲保恩

(山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所，山東省化學藥物重點實驗室，山東 濟南 250101)

水質指的是水體的物理(如色度、濁度、臭味等)、化學(無機物和有機物的含量)和生物(細菌、微生物、浮游生物、底棲生物)的特性及其組成的狀況。實驗室中的用水一般為飲用水、各種純化水、注射用水等。飲用水(Drinking water)為天然水經(jīng)凈化處理所得的水;純化水(Purified water)為原水經(jīng)蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制得的制藥用的水，不含任何附加劑;注射用水(Water for injection)是以純化水作為原水，經(jīng)特殊設計的蒸餾器蒸餾、冷凝冷卻后經(jīng)膜過濾制備而得的水?！痘瘜W藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》［1］規(guī)定:凡是注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應的其他藥物制劑均應進行溶血性試驗，附錄中溶血試驗方法推薦的陽性對照管為蒸餾水。為比較飲用水、各種純化水、滅菌注射用水等不同水質水對陽性結果的影響，故進行本實驗，以便得出在溶血試驗中溶血效果更好的陽性對照。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

單列二孔恒溫水溫鍋，型號 DZKEW-C，上海樹立儀器儀表有限公司;臺式低速大容量離心機，型號TDL-5型，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;紫外分光光度計，型號 UV2201型，日本島津公司;自動雙重純水蒸餾器，型號SZ-93A，上海亞榮生化儀器廠。

1.1.2 動物

新西蘭兔，體重2.5Kg左右，雌雄不限，由濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號【SCXK(魯)20100005】。取血在本中心普通環(huán)境動物實驗設施進行，實驗動物使用許可證號【SYXK(魯)20100004】。

1.2 方法［2－5］

1.2.1 幾種水質的準備

滅菌注射用水:批號1208222購自天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司;純凈水:批號20120331購自娃哈哈集團有限公司;雙蒸水:本中心采用自動雙重純水蒸餾器制備;去離子水:由濟南誠言經(jīng)貿(mào)有限公司提供;純水:本中心采用動物飲用純水處理器制備。

1.2.2 2%紅細胞懸液制備

采用家兔心臟取血方法，取血約10 mL。將血液迅速置燒杯中，用竹簽攪拌去除纖維蛋白原，使成脫纖血液。加入約10倍量的0.9%氯化鈉注射液，混勻后離心15 min(1500 r/min)，去除上清液，再加入0.9%氯化鈉注射液按上述方法反復洗滌2～3次，至上層液體不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉注射液稀釋成2%(V/V)的混懸液備用。

1.2.3 溶血試驗

取潔凈試管7支，進行編號，1～7號管為不同水質管，分別為純水、雙蒸水、滅菌注射用水、去離子水、純凈水、飲用水、0.9%氯化鈉注射液。按表1所示依次加入2%紅細胞混懸液、0.9%氯化鈉注射液或各種水質，每個編號設3個平行管將各管輕輕搖勻，立即置恒溫水浴鍋中(37±0.5)℃保溫3 h。

1.2.4 結果判斷標準

1.2.4.1 常規(guī)溶血試驗體外試管法(肉眼觀察法)

若試管底無細胞殘留或有少量紅細胞殘留，溶液呈澄明紅色，表示完全溶血，記為“+”;若試管中紅細胞逐漸下沉，上層液體無色澄明或藥物顏色澄明，表明無溶血發(fā)生，記為“-”;若試管中紅細胞逐漸下沉，試管底有大量紅細胞殘留，溶液呈澄明紅色，表示部分溶血，記為“±”。若溶液中有棕紅色或或紅棕色絮狀沉淀，振搖試管后絮狀沉淀不分散，或用滴管吸取凝聚的絮狀物滴在載玻片上，在凝聚物邊緣滴加2滴0.9%氯化鈉注射液，置顯微鏡下觀察，凝聚物不被沖散者為真凝聚，記為“+”;若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖試管后絮狀沉淀均勻分散開，或用滴管吸取凝聚的絮狀物滴在載玻片上，在凝聚物邊緣滴加2滴0.9%氯化鈉注射液，置顯微鏡下觀察，凝聚物能被沖散者為假凝聚，記為“-”。

1.2.4.2 改進的體外溶血試驗法(分光光度法)

恒溫水浴鍋37℃溫孵3 h，離心15 min(1500 r/min)，每管取上清3 mL于石英杯中，用分光光度計測定。0.9%氯化鈉注射液調零后，于545 nm波長處測定各管上清液吸收度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理法

采用DAS1.0軟件對各管的吸光度值進行統(tǒng)計分析，結果以表示。

2 結果

2.1 體外溶血肉眼觀察

將不同水質水與2%兔血紅細胞混合，通過肉眼觀察其溶血程度。結果見表2。試驗結果表明，純水、雙蒸水、滅菌注射用水、去離子水、純凈水、飲用水等幾種不同水質水均有溶血現(xiàn)象發(fā)生，但是溶血程度不同。純水、雙蒸水、滅菌注射用水、去離子水、純凈水等5種水質隨著時間的延長，肉眼觀察并無差異，上清均為澄明紅色，而飲用水隨著時間的延長，紅細胞破裂較少，大量紅細胞下沉，上清為澄明淡黃色。顯微鏡下觀察，飲用水管紅細胞數(shù)量明顯多于其它各管，各管均未見紅細胞凝聚。各管經(jīng)振搖后可見紅細胞均勻散開，證明無紅細胞凝聚。

表1 體外溶血試驗加樣表Tab.1 Sample list of hemolysis test in vitro

表2 幾種不同水質水的溶血作用(肉眼觀察法)Tab.2 Hemolysis of several character water(macroscopic observation methods)

2.2 體外溶血的吸光度比較

分別用紫外分光光度計測定各管的吸光度，測定其對紅細胞的影響。結果見表3。試驗結果表明，分光光度計法與肉眼觀測結果一致，溶血程度輕的飲用水管吸光度也小，其它各管吸光度也有差異。幾種水質對兔血紅細胞的溶血程度為滅菌注射用水＞純凈水 ＞雙蒸水 ＞純水 ＞去離子水 ＞飲用水。

3 討論

天然水質中通常含有很多雜質，包括電解質、有機物質、顆粒物、微生物和溶解氣體等，生活中的飲用水其質量必須符合國家的標準GB5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》。水的純化，就是指去掉這些雜質，雜質去除的越徹底，水也就越純凈。蒸餾

水與超純水，去離子水，其實都是純度非常高的水，水中的雜質含量很少，一般電導率都在1us/cm以下，主要區(qū)別在于制作工藝的不同，以及有些雜質含量有區(qū)分。去離子水的制備是飲用水完全或不完全地去除離子物質，主要采用過RO膜和混床樹脂處理方法;蒸餾水的制備則是利用液體混合物中各組分揮發(fā)度的差別，使H2O汽化并隨之使蒸氣部分冷凝分離而得的水，雙蒸水是指將經(jīng)過一次蒸餾后的水，再次蒸餾所得到的水;純水也稱RO水，是通過反滲透膜過濾后的水，反滲透膜的孔徑一般為10～100A之間，所以它能夠去除95%以上的離子態(tài)雜質;純凈水也稱為雙級反滲透水、雙級RO水，娃哈哈純凈水采用美國二級反滲透技術，注射用水是純化水再次蒸餾得到，中國藥典則規(guī)定注射用水的生產(chǎn)工藝必須是蒸餾，可以分別以純化水、去離子水等為源水，制備得到符合標準的注射用水。按2010版中國藥典規(guī)定［6］，飲用水可作為藥材凈制時的漂洗、制藥用具的粗洗用水，純化水可作為配制普通的藥物制劑溶劑或試驗用水，不得用于注射劑的配制與稀釋，注射用水可作為配制注射劑用的溶劑，滅菌注射用水用于滅菌粉末的溶劑或注射液的稀釋劑。由此可見，水的等級順序由低到高依次是是飲用水、去離子水、純水(RO水)、雙蒸水、純凈水(雙級反滲透水、雙級RO水)、滅菌注射用水。

對溶血試驗操作報道的文獻較多，方法不盡相同，程大任等［7］就其不同的方法以及可能會對結果產(chǎn)生影響的條件進行了考察，結果顯示，動脈或靜脈血用于試驗對溶血結果沒有顯著影響，故本實驗采用易于操作的心臟取血法。本試驗研究結果表明:滅菌注射用水、純凈水、雙蒸水、純水、去離子水、飲用水等幾種水質，均能發(fā)生肉眼及顯微鏡下可見的溶血反應，但同時也可以看到，不同水質對家兔紅細胞的溶血反應不盡相同。由試驗結果可知，水的純度越大，所含離子越少，吸光度越高，溶血反應越大。在溶血試驗中陽性對照推薦使用滅菌注射用水。

表3 幾種不同水質水的溶血作用(分光光度法)(n=3)Tab.3 Hemolysis of several character water(spectrophotometry)

［1］化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》課題研究組.化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則［S］.國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，2005:25-27.

［2］沈放，楊黎江，彭永芳，等.重樓皂苷類化合物溶血作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(9):2280-2281.

［3］鄧元榮，卓儀榮，王玲.油茶皂苷的體外溶血試驗研究［J］.海峽藥學，2008，20(12):9-32.

［4］張劍峰，項崢，竇德強.血塞通注射液溶血檢測方法研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2011，13(1):34-38.

［5］袁伯俊，廖明陽，李波.藥物毒理學試驗方法與技術［M］.第1版.北京:化學工業(yè)出版社，2007:259-261.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄XVI.

［7］程大任，付銳，竇德強.人參皂苷溶血及抗溶血作用研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2007，9(4):19-23.