陳麗春，王菲菲

（1.浙江科技學院 生物與化學工程學院，杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室，杭州310023）

洋甘菊又稱母菊，主要分德國洋甘菊和羅馬洋甘菊兩種。為菊科甘菊屬的花序或全草，一年生或兩年生草本植物。主要產(chǎn)于東歐、埃及、北美、比利時、英國等國家，為一種重要的藥用植物和香料植物。洋甘菊在歐洲、美國及日本等地早已被廣泛利用，成為眾所周知的藥用植物和香料植物，不少國家加以大面積機械化生產(chǎn)。洋甘菊花朵具有水果香，主要含有揮發(fā)油、黃酮類、愈創(chuàng)薁內(nèi)酯、香豆素類等成分。作為一種引進植物，洋甘菊在中國尚未得到充分的開發(fā)及利用［1－3］。大量的實驗表明，洋甘菊具有消炎、抑制真菌、解痙等作用［4－6］，具有顯著的社會經(jīng)濟效益。

芹菜苷為洋甘菊中的一種活性黃酮類物質(zhì)［7］，可作為平滑肌的解痙劑，醛糖還原酶抑制劑和鎮(zhèn)靜劑。由于對洋甘菊中芹菜苷質(zhì)量濃度的研究較少，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）［8－11］建立了HPLC測定芹菜苷質(zhì)量濃度的方法，為更好地研究洋甘菊的藥用價值和具體成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芹菜苷標準品（批號20110908，上海永恒生物科技有限公司），色譜甲醇（Tedia，United States of America），優(yōu)級純乙酸（上海國藥集團化學試劑有限公司），其他試劑均為分析純，洋甘菊（新疆種植，購于杭州濱江藝福堂）。

1.2 儀器與設備

儀器設備：日本島津高效液相色譜儀（型號規(guī)格：LC－20AD，配有SPD－20A可變波長紫外檢測器，CTO－20A柱溫箱，手動進樣閥），超純水器（Direct－Q?3，MILLIPORE，made in France），KQ－50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），玻璃砂芯過濾裝置（上海興亞凈化材料廠），GZX－9076MBE電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.3 標準品儲備液和供試品的制備

標準品儲備液的配置：精密稱取5.05mg芹菜苷標準品（質(zhì)量分數(shù)大于99%），用色譜級甲醇溶解配置質(zhì)量濃度為0.499 95mg/mL芹菜苷標準品儲備液，搖勻，用0.22μm膜過濾。根據(jù)實驗需要，稀釋配成所需質(zhì)量濃度。

供試品的制備：精密稱取干燥洋甘菊（過40目篩）126.4g，以70%乙醇，料液比為1∶18，在70℃下回流浸提2.5h，抽濾，再稱定質(zhì)量，70%乙醇補足失重，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱：依利特Sinochrom ODS－BP柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為甲醇（A）－1%乙酸水溶液（B），洗脫條件為：V（A）∶V（B）＝40∶60；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測（紫外）波長：333nm；進樣量：10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學試驗

2.1.1 線性關系考察

用移液槍精密量取上述標準品儲備液配置成質(zhì)量濃度分別為0.999 9、1.999 8、3.999 6、4.999 5、24.997 5、39.996 0、49.995 0、99.990 0μg/mL的標準品溶液。在上述色譜條件下檢測峰面積，平行測定5次，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，繪制標準曲線。芹菜苷的線性回歸方程為：y＝41 616x－3 013.3，R2＝0.999 9。結(jié)果表明，芹菜苷在0.999 9～99.99μg/mL間線性關系良好（圖1）。

圖1 芹菜苷標準曲線圖Fig.1 Standard curve of apigenin

2.1.2 精密度考察

日內(nèi)精密度：在上述色譜條件下，將2.999 7μg/mL的標準品溶液在0、2、4、6、8h，進行測定，記錄色譜峰面積，連續(xù)進樣5次，測定峰面積，計算峰面積的RSD%＝1.68%。

日間精密度：在上述色譜條件下，將對照品溶液連續(xù)3d，每天進樣2次，測定峰面積，計算峰面積的RSD%＝1.94%。結(jié)果表明，此方法的精密度良好。

2.1.3 重現(xiàn)性考察

取洋苷菊提取液1mL置于10mL容量瓶中，用色譜甲醇定容至刻度，平行制備5份溶液，分別取適量溶液于1.5mL進樣瓶中，用0.45μm微孔濾膜過濾，在上述色譜條件下進行HPLC分析，分別測定峰面積，計算峰面積的RSD%＝2.11%。結(jié)果表明，此方法的重復性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性考察

取一份樣品溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾，取適量溶液于1.5mL進樣瓶中，分別在0、2、4、8、12、24h進樣，在上述色譜條件下進行HPLC分析，分別進行峰面積的測定，計算峰面積的RSD%＝2.28%。結(jié)果表明，此方法在室溫下24h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收試驗

取1mL洋甘菊提取物，稀釋10倍定容，加入芹菜苷標準品37.3μg，用5mL的容量瓶定容，即為加標試樣。平行制備5組溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾，在上述色譜條件下進行HPLC分析，分別測定峰面積，從而計算平均回收率為1.04%，RSD%＝1.87%（表1）。

表1 芹菜苷加樣回收試驗結(jié)果Table 1 Sample recovery test of apigenin

3 分析與討論

3.1 樣品的測定與分析

在上述色譜條件下進行HPLC分析，測定峰面積，保留時間在23.748min處為芹菜苷，代入標準曲線計算芹菜苷的質(zhì)量濃度。測得芹菜苷在洋甘菊中的質(zhì)量濃度為83.205mg/L（圖2，圖3）。

圖2 洋甘菊提取物的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of chamomile extract

圖3 洋甘菊提取物加芹菜苷標準品的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of chamomile extract adding apigenin standard substance

3.2 討 論

3.2.1 提取溶劑的選擇

本研究考察了乙醇－水混合溶劑作為提取溶劑對提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當乙醇與水體積比為70∶30時，提取效果較好，芹菜苷質(zhì)量濃度較高。因此，選用了乙醇與水體積比為70∶30。

3.2.2 檢測波長的選擇

用UV－5500PC型紫外/可見分光光度計進行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，芹菜苷在267nm和333nm處有特征吸收峰，其在333nm處吸收峰達最大。所以，本次實驗選取的檢測波長為333nm。

3.2.3 流動相比例的選擇

查閱相關文獻，經(jīng)過比較選擇了甲醇－乙酸為流動相，考察了不同比例甲醇－乙酸對芹菜苷和其他組分的分離情況。發(fā)現(xiàn)甲醇與1%乙酸的體積比為40∶60時，芹菜苷能與其他組分完全分離。

4 結(jié) 語

試驗結(jié)果表明，該HPLC方法穩(wěn)定，測得結(jié)果準確，重復性好，能用于測定洋甘菊中芹菜苷的質(zhì)量濃度。對所測得數(shù)據(jù)進行分析可得，洋甘菊中芹菜苷的質(zhì)量濃度較低，資料顯示芹菜中有著較高的芹菜苷的質(zhì)量濃度。另外在樣品的提取時，通過對原料和產(chǎn)品的檢測發(fā)現(xiàn)，大孔樹脂能起到初步富集洋甘菊中芹菜苷的作用，且AB－8型大孔樹脂效果最好。

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