衛(wèi)曉怡，白 晨,*，唐立偉，陸 紅，張靖偉

(1.上海商學院旅游與食品學院，上海 200235；2.復旦大學生命科學學院，上海 200433)

花色苷(anthocyanin)是一種廣泛分布在植物中的黃酮類(flavonoid)植物化學物[1]，從食物或植物中提取的花色苷往往含有不同的花色苷元，如矢車菊素(cyanidin)、天竺葵素(pelargonidin)、芍藥素(petunidin)、錦葵素(malvidin)等，糖苷也可以分為單糖苷、雙糖苷、三糖苷等結(jié)構(gòu)，這些不同結(jié)構(gòu)的單體花色苷具有不同的生理活性。

花色苷有諸多療效，如抗氧化[2-3]、抗動脈粥樣硬化[4]、抗胰島素抵抗[5]、調(diào)節(jié)血脂[6-7]等，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy-3-g)是其主要活性成分。最新研究報道[8]顯示，紫玉米花色苷可以抑制高脂誘導肥胖小鼠的體質(zhì)量增長，但其有效成分和作用機制尚不明確，推測是紫玉米花色苷中含量為7%的Cy-3-g起了主要作用。

脂蛋白脂肪酶(lipoprtein lipase，LPL)是一種甘油三酯(triglyceride，TG)的限速性水解酶，水解血漿中的TG，使TG的1位和3位酯鍵斷裂，釋放出游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)。同時，LPL在骨骼肌和脂肪組織中具有組織特異性，是FFA進入脂肪細胞儲存或是進入骨骼肌細胞氧化利用的關(guān)鍵性酶，與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。

肌肉組織通過LPL產(chǎn)生FFA，F(xiàn)FA氧化分解提供能量。增加骨骼肌中LPL活性，可以使骨骼肌中的β-脂肪酸氧化增強，從而加速清除體內(nèi)循環(huán)的TG。脂肪組織的一個主要功能就是儲存脂肪。降低脂肪組織中的LPL，可以減少脂肪組織利用LPL水解TG產(chǎn)生的FFA合成脂肪，使FFA轉(zhuǎn)移到其他具有高氧化分解作用的組織，如肌肉組織進行氧化分解。高的脂肪/肌肉LPL比，意味著使食物中攝入的脂肪更易積聚在脂肪組織；低的脂肪/肌肉LPL比，則意味著循環(huán)中的TG會更多的流向骨骼肌氧化利用，而不是流向脂肪組織積聚，利于抑制脂肪在脂肪組織中的儲存，減輕體質(zhì)量[9-10]。LPL在肌肉和脂肪組織中的活性，以及它們的活性比率，是機體調(diào)節(jié)膳食攝入的脂肪用于供能還是儲存的關(guān)鍵[11]。例如，進食后脂肪組織的LPL活性會升高，肌肉組織降低[12]；反之，禁食可引起脂肪組織LPL活性降低，肌肉組織升高[13-14]。這種LPL在肌肉和脂肪中截然相反的變化，可以使機體在食物充足時，最大限度地儲存能量；在食物稀缺時，為肌肉組織提供能量。

花色苷提取物可抑制小鼠肥胖[8]，但其作用機制仍不明確。本實驗前期研究及相關(guān)實驗結(jié)果表明，花色苷Cy-3-g通過激活成熟脂肪細胞一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)抑制LPL活性[15]。然而，Cy-3-g對骨骼肌細胞LPL的作用及其機制仍不明確，有待研究。本研究以花色苷Cy-3-g干預骨骼肌細胞，就Cy-3-g對細胞LPL活性的影響及其機制進行探討，闡明Cy-3-g通過AMPK激活骨骼肌細胞LPL活性，調(diào)節(jié)TG代謝的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性SD大鼠(SPF級)，體質(zhì)量180～200g。

矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-g) 芬蘭Polyphenols AS公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、膠原酶、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、蛋白裂解液(RIPA) 美國Sigma公司；杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸-克-林二氏重碳酸鹽溶液(HEPES-KRBH緩沖液)、抗生素(青霉素/鏈霉素)、Trizol Reagent、SYBR Green、First Strand cDNA Synthesis Kit、大鼠LPL引物合成、大鼠β-actin引物合成 美國Invitrogen公司；胰酶、胎牛血清(FBS) 美國Gibco公司；Anti-LPL Polyclonal Antibody、Anti-β-actin Monoclonal Antibody 美國Santa Cruz Biotechnology公司；Anti-pAMPK Polyclonal Antibody、AMPK Polyclonal Antibody 美國Cell Signaling Technology公司；LuminGLO?發(fā)光試劑盒 美國Thermo Scientific公司。

1.2 儀器與設備

微孔濾器(0.22μm) 德國Millipore公司；濾網(wǎng) 廣州展晨生物技術(shù)有限公司；細胞培養(yǎng)板(瓶) 美國Corning公司；倒置顯微鏡 瑞士Leica公司；低溫高速離心機(Universal 16R)、冷凍離心機 德國Hettich Zentrifugen公司；電泳儀(POWER/PAC200) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 骨骼肌細胞分離培養(yǎng)

取雄性SD大鼠(180～200g)，斷頸法處死，無菌條件下取骨骼肌(后腿)，PBS洗3次，剔除脂肪、結(jié)締組織，剪碎，靜置1min，棄去上層液及漂浮組織。37℃用1μg/mL胰酶的DMEM消化，每5min搖動或吹打1次離心管，然后加入培養(yǎng)基終止消化。4℃、2000r/min離心5min，沉淀物用含10%的胎牛血清DMEM重懸，80μm尼龍濾網(wǎng)過濾。血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，細胞2×106接種于35mm的培養(yǎng)皿中，差速貼壁去除成纖維細胞。置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日更換培養(yǎng)基。

1.3.2 Cy-3-g對細胞毒性、增殖的測定

收集對數(shù)生長期的細胞，在96孔板以1×104細胞/孔接種細胞。用濃度1、10、20、50、100μmol/L Cy-3-g作用于細胞24h后，收集細胞培養(yǎng)液，吸取培養(yǎng)液上清進行測定。采用2,4-二硝基苯肼比色法檢測Cy-3-g對骨骼肌細胞細胞毒性，即對乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放的影響，于540nm波長處測定吸光度。采用MTT法檢測Cy-3-g對骨骼肌細胞增殖的影響。

1.3.3 Cy-3-g對細胞的干預處理

以DMSO為溶劑，配制成100mmol/L的Cy-3-g高濃度母液，使用時，將DMEM培養(yǎng)基稀釋為一定比例濃度。細胞以終濃度為1、10、20、50、100μmol/L Cy-3-g干預3h，或者以100μmol/L Cy-3-g濃度干預1、2、3、4、5h，其中，對照樣細胞加入0.1% DMSO。

1.3.4 細胞LPL活性測定

骨骼肌細胞1×104個/mL接種于培養(yǎng)皿。10%甲醛鈣固定，行細胞非特異脂肪酶染色[16]。根據(jù)LPL能水解酯鍵的原理，用吐溫-60孵育液(0.05mol/L Tris-HCl 90mL+5% 吐溫-60 4mL+10%氯化鈣4mL)與細胞一起37℃孵育12h，分解出的脂肪酸與鈣結(jié)合沉淀于脂肪酶所在位置，加2%硝酸鉛處理10min，以鉛置換鈣，經(jīng)1%硫化銨液作用，形成棕色至棕黑色的硫化鉛細胞，經(jīng)蘇木精復染細胞核5min，光鏡下每張片取12個視野，平行重復3次，計細胞總數(shù)和脂肪酶染色陽性細胞數(shù)。

1.3.5 實時熒光定量RT-PCR

按T r i z o l 試劑的使用操作步驟提取總R N A，按試劑盒使用說明配制反應體系，進行R T-P C R實驗，平行重復3 次，并設空白對照。各基因引物序列為：LPL (Gene Accession NO： BC003305)，(F)：5’-CCAATCGTTAGCATTTCGTTTGAG-3’，(R)：5’-T T G C G C A G T G C A G A A T T T G A-3’，β-actin (Gene Accession NO： NM_031144)(F)：5’-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3’，(R)：5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’。RT-PCR擴增條件：94℃預變性1min后，進行96℃變性50s，59℃退火45s，74℃延伸45s，共35個循環(huán)。

1.3.6 Compound C抑制細胞pAMPK

骨骼肌細胞加入AMPK抑制劑Compound C 40μmol/L預處理1h后，以100μmol/L Cy-3-g干預3h為干預組，加入溶劑0.1% DMSO為對照組。

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting)

Western Blotting法檢測骨骼肌細胞pAMPK(Thr172)以及LPL蛋白表達。Cy-3-g干預細胞結(jié)束后，用PBS洗滌細胞3遍，取適量的RIPA蛋白裂解液4℃振蕩孵育10min充分裂解。收集至1.5mL離心管中，12000×g離心5min，取上清。使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，抗體使用：LPL抗體，pAMPK (Thr 172)抗體，β-actin抗體用于測定，采用LuminGLO?發(fā)光試劑盒熒光顯色。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用SPPS16.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，并進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果以±s表示。多組均數(shù)進行方差齊性檢驗(homogeneity of varirnces)和單因素方差分析(oneway ANOVA)；各組間兩兩比較采用 Tukey’s honestly法，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨骼肌細胞的形態(tài)學觀察

圖 1 原代骨骼肌細胞 (×100)Fig.1 Skeletal muscle cells isolated from rat hind leg (×100)

用顯微鏡對細胞進行形態(tài)學觀察并進行拍攝，見圖1。剛分離的骨骼肌細胞呈圓球狀，體積較小，胞體透亮，形態(tài)完整，分散度較好，折光性強。細胞培養(yǎng)2h后開始出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象；12h后，大約有90%以上的細胞貼壁生長。培養(yǎng)24h后，貼壁的細胞其形態(tài)上發(fā)生明顯改變，細胞逐漸延展成梭形，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖、遷移并逐漸規(guī)律性地沿一個方向排列，自動收縮。

2.2 Cy-3-g對細胞毒性、增殖的影響

LDH是反映細胞膜完整性的一個重要指標。MTT法主要是反映線粒體的功能，MTT法顯色深淺與培養(yǎng)板孔內(nèi)活細胞數(shù)量成正比，即吸光度隨活細胞的增加而升高。用1、10、20、50、100μmol/L的Cy-3-g分別與骨骼肌細胞培養(yǎng)24h，骨骼肌細胞各組間LDH釋放、MTT吸光度無顯著性差異(P＞0.05，結(jié)果略)，說明實驗涉及的各Cy-3-g濃度對骨骼肌細胞無毒性及增殖影響。

2.3 Cy-3-g對骨骼肌細胞LPL活性的影響

圖 2 Cy-3-g對骨骼肌細胞LPL活性的影響(±s，n=3)Fig.2 Effect of Cy-3-g on LPL activity in the skeletal muscle cells(±s，n=3)

骨骼肌細胞的LPL活性以脂肪酶染色陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比表示。由圖2可知，Cy-3-g上調(diào)骨骼肌細胞LPL活性，具有劑量和時間效應。

2.4 Cy-3-g對細胞LPL表達的影響

圖 3 Cy-3-g對骨骼肌細胞LPL mRNA以及蛋白表達的影響(±s，n=3)Fig.3 Effect of Cy-3-g on LPL mRNA and mass expression in the skeletal muscle cells (±s，n=3)

由圖3可知，Cy-3-g上調(diào)骨骼肌細胞LPL mRNA以及蛋白表達，具有劑量和時間效應。

2.5 pAMPK在Cy-3-g調(diào)節(jié)細胞LPL中的作用

為明確pAMPK在Cy-3-g調(diào)節(jié)骨骼肌細胞LPL中的作用，利用pAMPK抑制劑Compound C阻斷pAMPK后，用Western Blotting檢測Cy-3-g對骨骼肌細胞LPL的影響。結(jié)果顯示，骨骼肌細胞用100μmol/L Cy-3-g干預3h，可以激活AMPK(P＜0.001)，同時增加LPL蛋白表達(P＜0.001)。用AMPK抑制劑 Compound C可以阻斷Cy-3-g對骨骼肌細胞AMPK的激活，同時LPL蛋白表達不增加，見圖4。結(jié)果表明，Cy-3-g通過激活AMPK來上調(diào)細胞的LPL活性，pAMPK是Cy-3-g調(diào)節(jié)骨骼肌細胞LPL活性的上游調(diào)控因子。

圖 4 pAMPK對Cy-3-g減少骨骼肌細胞LPL表達的影響(±s，n=3)Fig.4 Modulation of Cy-3-g on LPL through pAMPK activation in the skeletal muscle cells(±s，n=3)

3 結(jié) 論

本實驗建立了穩(wěn)定的骨骼肌細胞分離培養(yǎng)方法。肌肉組織增殖能力強，一般可分離培養(yǎng)原代骨骼肌細胞。骨骼肌細胞分離，可以采用組織塊法或酶消化法進行原代培養(yǎng)。本實驗采用酶消化法，能夠較大量地分離出骨骼肌細胞。采樣大鼠骨骼肌應注意去除附著的脂肪組織，用PBS清洗數(shù)次，去除含血細胞及破碎組織。初分離的大鼠骨骼肌細胞中，會伴隨生長成纖維細胞，可以在細胞貼壁后，利用成纖維細胞極易為0.25%胰酶所消化而從培養(yǎng)瓶壁上脫落，而骨骼肌細胞貼壁牢固的特點，通過多次短時間胰酶消化，去除成纖維細胞，純化骨骼肌細胞。

實驗結(jié)果表明，骨骼肌細胞LPL的活性以及mRNA、蛋白表達則均受Cy-3-g的上調(diào)，具有劑量和時間效應；并以pAMPK抑制劑Compond C阻斷Cy-3-g對AMPK的激活，結(jié)果顯示Cy-3-g對骨骼肌細胞LPL的上調(diào)是通過激活AMPK產(chǎn)生的，pAMPK是Cy-3-g調(diào)節(jié)LPL活性的上游調(diào)控因子。

目前，有報道[17]稱黃酮類物質(zhì)可以調(diào)節(jié)肌肉組織中LPL，從山楂葉中提取的山楂黃酮(純度＞94%)，劑量按4、8、6mg/kg體質(zhì)量灌胃，干預高脂血癥ICR小鼠8周，可以升高肌肉組織LPL含量。花色苷是一種黃酮類化合物，然而由于其碳環(huán)帶有陽性氧離子、極性較強、很少以苷元的形式存在、不同的pH值條件下化學結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變等特征，提示花色苷具有一些不同于其他黃酮類物質(zhì)的理化特性。本研究結(jié)果表明，Cy-3-g可上調(diào)骨骼肌細胞LPL活性以及mRNA、蛋白表達。

機體肌肉組織和脂肪組織對LPL活性的反向調(diào)節(jié)與肥胖密切相關(guān)。比如，身體鍛煉可以通過升高肌肉組織的LPL活性，使得FFA氧化供能增強，從而降低脂肪組織的LPL活性，減少體質(zhì)量[14]。前期及本研究結(jié)果表明，Cy-3-g在骨骼肌細胞中上調(diào)LPL以促進FFA氧化利用，在成熟脂肪細胞中下調(diào)LPL[15]以抑制其利用FFA合成脂肪并積聚，產(chǎn)生低脂肪/肌肉LPL比，有利于抑制機體肥胖。

AMPK作為“細胞能量的感受器”，是調(diào)節(jié)脂肪-骨骼肌之間脂代謝的紐帶。AMPK激活下游靶蛋白酶，開啟分解代謝，關(guān)閉合成代謝，使ATP產(chǎn)生增多[18]。在脂肪組織、肝臟等部位，AMPK通過抑制乙酰CoA羧化酶亞型1(acetyl CoA carboxylase，ACC-1)來抑制脂肪的合成；在肌肉、心肌等部位，AMPK通過抑制ACC-2和增強肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)的活性來促進FFA的氧化[18-19]。在其作用下，糖酵解加強，肝臟糖異生減少，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達和轉(zhuǎn)位增強，細胞對葡萄糖攝取增加；脂肪酸氧化增強，脂肪合成抑制[20]。前期及本研究結(jié)果[14]表明，Cy-3-g可以激活骨骼肌細胞和成熟脂肪細胞AMPK，提示Cy-3-g通過AMPK調(diào)節(jié)脂肪-骨骼肌之間脂代謝。

有研究表明[21]，在肌細胞中AMPK是LPL的上游調(diào)控因子。二甲雙胍(metformin)、AMPK激動劑AICAR(5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonucleotide，5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸)可以激活L6骨骼肌細胞AMPK，并通過pAMPK上調(diào)LPL。本細胞實驗通過對pAMPK的阻斷，證明pAMPK是Cy-3-g調(diào)節(jié)骨骼肌細胞LPL的上游調(diào)節(jié)因子，與上述研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，花色苷Cy-3-g通過激活AMPK上調(diào)骨骼肌細胞LPL活性，提示Cy-3-g具有潛在的調(diào)節(jié)機體脂代謝作用，與含Cy-3-g的花色苷提取物的肥胖抑制作用密切相關(guān)。

[1] OZGA J A, SAEED A, WISMER W, et al. Characterization of cyanidin- and quercetin-derived flavonoids and other phenolics in mature saskatoon fruits (Amelanchier alnifolia Nutt.)[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55(25)： 10414-10424.

[2] KIM S H, JOO M H, YOO S H. Structural identification and antioxidant properties of major anthocyanin extracted from Omija (Schizandra chinensis) fruit[J]. J Food Sci, 2009, 74(2)： 134-140.

[3] STEED L E, TRUONG V D. Anthocyanin content, antioxidant activity, and selected physical properties of flowable purple-fleshed sweetpotato purees[J]. J Food Sci, 2008, 73(5)： 215-221.

[4] MAURAY A, FELGINES C, MORAND C, et al. Bilberry anthocyanin-rich extract alters expression of genes related to atherosclerosis development in aorta of apo E-deficient mice[J]. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 2012, 22(1)： 72-80.

[5] INAGUMA T, HAN J, ISODA H. Improvement of insulin resistance by Cyanidin 3-glucoside, anthocyanin from black beans through the up-regulation of GLUT4 gene expression[J]. BMC Proc, 2011, 5(Suppl 8)： 21.

[6] GUO H, LING W, WANG Q, et al. Effect of anthocyanin-rich extract from black rice (Oryza sativa L. indica) on hyperlipidemia and insulin resistance in fructose-fed rats[J]. Plant Foods Hum Nutr, 2007, 62(1)： 1-6.

[7] QIN Y, XIA M, MA J, et al. Anthocyanin supplementation improves serum LDL- and HDL-cholesterol concentrations associated with the inhibition of cholesteryl ester transfer protein in dyslipidemic subjects[J]. Am J Clin Nutr, 2009, 90(3)： 485-492.

[8] TSUDA T, HORIO F, UCHIDA K, et al. Dietary cyanidin 3-O-beta-D-glucoside-rich purple corn color prevents obesity and ameliorates hyperglycemia in mice[J]. J Nutr, 2003, 133(7)： 2125-2130.

[9] HAEMMERLE G, ZIMMERMANN R, STRAUSS J G, et al. Hormone-sensitive lipase deficiency in mice changes the plasma lipid profile by affecting the tissue-specific expression pattern of lipoprotein lipase in adipose tissue and muscle[J]. J Biol Chem, 2002, 277(15)： 12946-12952.

[10] PREISS-LANDL K, ZIMMERMANN R, HAMMERLE G, et al. Lipoprotein lipase： the regulation of tissue specific expression and its role in lipid and energy metabolism[J]. Curr Opin Lipidol, 2002, 13(5)： 471-481.

[11] COSTABILE G, ANNUZZI G, di MARINO L, et al. Fasting and postprandial adipose tissue lipoprotein lipase and hormone-sensitive lipase in obesity and type 2 diabetes[J]. J Endocrinol Invest, 2011, 34(5)： 110-114.

[12] DONAHOO W T, STOB N R, AMMON S, et al. Leptin increases skeletal muscle lipoprotein lipase and postprandial lipid metabolism in mice[J]. Metabolism, 2011, 60(3)： 438-443.

[13] ONG J M, KERN P A. Effect of feeding and obesity on lipoprotein lipase activity, immunoreactive protein, and messenger RNA levels in human adipose tissue[J]. J Clin Invest, 1989, 84(1)： 305-311.

[14] BESSESEN D H, ROBERTSON A D, ECKEL R H. Weight reduction increases adipose but decreases cardiac LPL in reduced-obese Zucker rats[J]. Am J Physiol, 1991, 261(2)： 246-251.

[15] KIM S J, NIAN C, MCINTOSH C H. Activation of lipoprotein lipase by glucose-dependent insulinotropic polypeptide in adipocytes. A role for a protein kinase B, LKB1, and AMP-activated protein kinase cascade[J]. J Biol Chem, 2007, 282(12)： 8557-8567.

[16] LEONHARDT U, RITZEL U, OTTLEBEN M, et al. Circulating human hepatic lipase mRNA in patients with hepatocellular carcinoma and healthy controls[J]. Eur J Surg, 1999, 165(6)： 539-542.

[17] FAN C, YAN J, QIAN Y, et al. Regulation of lipoprotein lipase expression by effect of hawthorn flavonoids on peroxisome proliferator response element pathway[J]. J Pharmacol Sci, 2006, 100(1)： 51-58.

[18] HARDIE D G, ROSS F A, HAWLEY S A. AMPK： a nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(4)： 251-262.

[19] JANOVSKA A, HATZINIKOLAS G, STAIKOPOULOS V, et al. AMPK and ACC phosphorylation： effect of leptin, muscle fibre type and obesity[J]. Mol Cell Endocrinol, 2008, 284(1/2)： 1-10.

[20] YEO W K, LESSARD S J, CHEN Z P, et al. Fat adaptation followed by carbohydrate restoration increases AMPK activity in skeletal muscle from trained humans[J]. J Appl Physiol, 2008, 105(5)： 1519-1526.

[21] AN D, PULINILKUNNIL T, QI D, et al. The metabolic “switch” AMPK regulates cardiac heparin-releasable lipoprotein lipase[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2005, 288(1)： 246-253.