杜仲葉樹脂分離純化產(chǎn)物的抗疲勞功效

劉 迪，尚 華，宋曉宇

(1.陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工與紡織學(xué)院，陜西 咸陽 721000；2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司乾縣分公司，陜西 西安 713300)

杜仲(Eucommia ulmoides)，為杜仲科杜仲屬，在我國(guó)有著悠久的藥用歷史，具有降血壓[1-3]、調(diào)節(jié)血糖[4-5]、保護(hù)肝臟[6]、強(qiáng)筋骨[7]等功效。杜仲作為中藥材的使用部位主要是杜仲皮，然而現(xiàn)代研究表明，杜仲葉與杜仲皮的成分含量相近[8-9]，甚至某些成分含量較杜仲皮高[10]。楊春霞等[11]的研究表明，杜仲葉具有抗疲勞功效，但另一方面目前所見的相關(guān)報(bào)道大多是以杜仲葉粗提物為研究對(duì)象，較少見對(duì)純化產(chǎn)物分析研究的相關(guān)報(bào)道，導(dǎo)致抗疲勞功效成分尚不十分明確。本研究采用大孔吸附樹脂分離純化杜仲葉粗提物，并測(cè)定得到2種分離純化產(chǎn)物中多酚物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別評(píng)價(jià)它們的抗疲勞功效，分析多酚與各產(chǎn)物抗疲勞功效的相關(guān)性，以探索杜仲葉抗疲勞作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉，由陜西略陽杜仲人工繁育基地提供。

XDA-8型大孔吸附樹脂 西安藍(lán)曉科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；福林-酚試劑(Folin-Ciocalteu) 美國(guó)Sigma公司；全血乳酸(LA)測(cè)試盒、血尿素氮(SUN)測(cè)試盒、肌糖原及肝糖原檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-400A粉碎機(jī) 北京科偉儀器有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；721可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HL-2恒流泵 上海亞榮有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 杜仲葉粗提物的制備

杜仲葉洗凈，用烘箱于50℃烘干，粉碎成粉，過60目篩。將提取溶劑按照1：10的料液比與杜仲葉粉混合，50℃恒溫水浴鍋中浸提1h，浸提3次，過濾，合并濾液，離心分離，上清液為杜仲葉粗提溶液。

1.4.2 樹脂分離

采用XDA-8型大孔吸附樹脂對(duì)杜仲葉粗提物進(jìn)行分離。樹脂經(jīng)過預(yù)處理后按照規(guī)定的方法裝柱，將1BV體積的杜仲葉粗提液以1BV/h的流速流過樹脂柱，然后依次用4BV左右的20%、40%、60%和80%乙醇溶液以1BV/h的流速進(jìn)行梯度洗脫。收集各洗脫溶液，減壓濃縮至干，真空冷凍干燥成粉。

1.4.3 多酚含量測(cè)定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用Folin-Ciocalteu[12]法對(duì)4種洗脫液干燥后的固體純化產(chǎn)物中多酚進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各樣品中的多酚含量。選取多酚含量最高的固體純化產(chǎn)物為EU1Ⅰ，多酚含量最低的固體純化產(chǎn)物為EU1Ⅱ，作為后實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

1.4.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組、EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組，每組40只，分籠飼養(yǎng)。小鼠在SPF動(dòng)物房中飼養(yǎng)，溫度為(23±1)℃，相對(duì)濕度為40%～60%，小鼠先在SPF動(dòng)物房適應(yīng)3d。用純水將EU1Ⅰ和EU1Ⅱ溶解成0.2g/mL的水溶液。每組小鼠每天用灌胃針灌胃1次，對(duì)照組灌胃純水，EU1Ⅰ組灌胃EU1Ⅰ，EU1Ⅱ組灌胃EU1Ⅱ，按0.1mL/10g(以體質(zhì)量計(jì))連續(xù)灌胃15d。小鼠每天定時(shí)進(jìn)行20～30min的游泳訓(xùn)練，在灌胃飼養(yǎng)期間自由飲水和進(jìn)食。

1.4.5 抗疲勞評(píng)價(jià)

1.4.5.1 體質(zhì)量測(cè)定

灌胃飼養(yǎng)前和末次灌胃后，分別稱量各組小鼠的體質(zhì)量。

1.4.5.2 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

末次灌胃1h后，分別從對(duì)照組、EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組取10只小鼠，然后在距小鼠尾尖1cm處負(fù)5%體質(zhì)量的橡皮泥，橡皮泥用保鮮膜包裹。將小鼠置于水深30cm、水溫(25.0±1.0)℃的水箱中，記錄小鼠自游泳開始至沉入箱底10s[11]不能浮上水面的時(shí)間為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。

1.4.5.3 LA測(cè)定實(shí)驗(yàn)[11]

末次灌胃1h后，分別從對(duì)照組、EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組取10只小鼠，然后在距小鼠尾尖1cm處負(fù)5%體質(zhì)量的橡皮泥，橡皮泥用保鮮膜包裹。將小鼠置于水深30cm、水溫(25.0±1.0)℃的水箱中游泳30min，然后立即取出摘眼球取血，血液被肝素抗凝后用分光光度法按照LA測(cè)試盒說明測(cè)定LA含量。

1.4.5.4 SUN、LDH[13]和糖原的測(cè)定[14]

末次灌胃1h后，分別從對(duì)照組、EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組取10只小鼠，將小鼠置于水深30cm、水溫(25.0±1.0)℃的水箱中游泳90min[11,14]，然后立即取出摘眼球取血，將血液在4000r/min條件下離心10min后取血清，用分光光度法按照SUN測(cè)試盒和LDH測(cè)試盒說明測(cè)定SUN含量和LDH活力。取血后的小鼠被處死，解剖后取肝臟和大腿處肌肉，用分光光度法按照肝糖原及肌糖原測(cè)試盒說明測(cè)定肝糖原和肌糖原含量。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，20%、40%、60%和80%乙醇洗脫液干燥以后的固體純化產(chǎn)物中多酚含量分別為49.07、34.38、12.24、12.36g/100g。20%乙醇洗脫液固體純化產(chǎn)物中多酚含量最高，60%乙醇洗脫液固體純化產(chǎn)物中多酚含量最低，所以選擇前者為EU1Ⅰ、后者為EU1Ⅱ；60%和80%乙醇洗脫液固體純化產(chǎn)物中多酚含量相當(dāng)。測(cè)定結(jié)果顯示，固體純化產(chǎn)物中多酚含量總的變化趨勢(shì)為隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的降低而升高，表明杜仲葉多酚物質(zhì)極性較大，適宜用極性較大的溶液分離純化。

2.2 抗疲勞功效結(jié)果

2.2.1 小鼠體質(zhì)量

圖 1 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ?qū)π∈篌w質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on body weights of mice

如圖1所示，灌胃飼養(yǎng)前和灌胃飼養(yǎng)后，各組小鼠的平均體質(zhì)量相差范圍在0.83～1.70g，3組間無明顯差異，說明EU1Ⅰ和EU1Ⅱ?qū)π∈篌w質(zhì)量無顯著影響(P＞0.05)。

2.2.2 小鼠游泳時(shí)間

如圖2所示，對(duì)照組小鼠平均負(fù)重游泳為47.01min，EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組小鼠平均負(fù)重游泳時(shí)間分別為62.52、59.26min，比對(duì)照組分別延長(zhǎng)了52.23%、44.29%，且差異顯著(P＜0.01)，表明EU1Ⅰ和EU1Ⅱ均可以顯著地延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，即二者可以顯著地提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐受力，表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗疲勞能力。

圖 2 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ?qū)π∈筘?fù)重游泳時(shí)間的影響Fig.2 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on weight-loaded swimming time of mice

2.2.3 小鼠血LA 含量

圖 3 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ?qū)π∈笱狶A含量的影響Fig.3 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on blood LA in mice

如圖3所示，對(duì)照組小鼠平均血LA含量為4.65mmol/L，EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組小鼠平均血LA含量分別為2.21mmol/L和2.82mmol/L，比對(duì)照組分別降低了52.5%、39.4%，且差異極顯著(P＜0.01)，EU1Ⅰ對(duì)小鼠LA含量的降低幅度要高于EU1Ⅱ。

血液中的LA在機(jī)體處于無氧條件下劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)大量產(chǎn)生，引起體內(nèi)pH值降低，如果這時(shí)LA不能被及時(shí)地從體內(nèi)清除，大量聚集的LA會(huì)導(dǎo)致機(jī)體平衡失調(diào)，從而引起疲勞。因此，防止LA的大量生成，或者加速LA的清除，均可起到減緩疲勞的作用，EU1Ⅰ和EU1Ⅱ正是通過降低血LA含量表現(xiàn)其具有抗疲勞的能力。

2.2.4 小鼠SUN含量

圖 4 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ?qū)π∈骃UN含量的影響Fig.4 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on SUN in mice

如圖4所示，對(duì)照組小鼠平均SUN含量為13.20mmol/L，EU1Ⅰ組小鼠平均SUN含量為11.26mmol/L，比對(duì)照組降低了14.7%，且差異顯著(P＜0.05)，表明EU1Ⅰ可以顯著地減少SUN含量；EU1Ⅱ組小鼠平均SUN含量為13.03mmol/L，比對(duì)照組只降低了1.28%，且無明顯差異，表明EU1Ⅱ不能顯著地減少SUN含量。

機(jī)體內(nèi)的能源物質(zhì)是機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生能量的來源，糖原和蛋白質(zhì)就屬于這些能源物質(zhì)。糖原在機(jī)體運(yùn)動(dòng)之初會(huì)首先被消耗，當(dāng)糖原消耗殆盡后蛋白質(zhì)就會(huì)隨之被代謝分解。蛋白質(zhì)被消耗的產(chǎn)物就是SUN，因此SUN含量的高低可以表明體內(nèi)蛋白質(zhì)被消耗的情況。如果機(jī)體具有很好的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷適應(yīng)能力，那么機(jī)體內(nèi)的SUN含量就會(huì)比較低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有EU1Ⅰ可以顯著地降低SUN含量，表明EU1Ⅰ可以顯著地提高機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)性。

2.2.5 小鼠肝糖原和肌糖原含量

圖 6 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ?qū)π∈蠹√窃康挠绊慒ig.6 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on hepatic glycogen in mice

如圖5、6所示，對(duì)照組小鼠平均肝糖原含量為35.46mg/g，EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組小鼠平均肝糖原含量分別為57.72、49.67mg/g，比對(duì)照組分別提高了62.77%、40.07%，且差異顯著(P＜0.01)，表明EU1Ⅰ和EU1Ⅱ可以非常顯著地增加小鼠肝糖原含量；對(duì)照組小鼠平均肌糖原含量為3.57mg/g，EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組小鼠平均肌糖原含量分別為5.07、4.77mg/g，3組間無明顯差異(P＞0.05)，說明EU1Ⅰ和EU1Ⅱ并沒有顯著地影響肌糖原含量。

機(jī)體內(nèi)的糖原分為肝糖原和肌糖原，肌糖原在運(yùn)動(dòng)中會(huì)首先被大量消耗，當(dāng)肌糖原被消耗盡后，為了滿足能量的需求，肝糖原就會(huì)開始被消耗，如果機(jī)體繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，肝糖原的儲(chǔ)存量就會(huì)不斷地減少，這時(shí)疲勞就會(huì)產(chǎn)生。EU1Ⅰ和EU1Ⅱ可以顯著地增加肝糖原的含量，從而延緩疲勞的產(chǎn)生。然而，二者對(duì)肌糖原含量的影響并不顯著，說明二者通過增加肌糖原含量延緩疲勞的作用有限。

2.2.6 小鼠LDH活力

圖 7 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ?qū)π∈驦DH活力的影響Fig.7 Effects of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on LDH activity in mice

EU1I和EU1Ⅱ?qū)π∈驦DH活力的影響見圖7。對(duì)照組小鼠平均LDH活力為10853.45U/L，EU1I組小鼠平均LDH活力為11247.75U/L，比對(duì)照組提高了3.64%，且差異顯著(P＜0.05)，表明EU1Ⅰ可以顯著地增強(qiáng)LDH活力；EU1Ⅱ組小鼠平均LDH活力為9844.33U/L，EU1Ⅱ組小鼠的LDH活力低于對(duì)照組，說明EU1Ⅱ沒有增強(qiáng)LDH活力的功能。

LA可以通過LDH的作用而被氧化，從而使LA得到清除，使體內(nèi)pH值恢復(fù)正常，減緩疲勞的產(chǎn)生。EU1Ⅰ提高了LDH活力，表明EU1Ⅰ可以通過提高LDH活力降低血LA含量，表現(xiàn)抗疲勞功效。2.2.3節(jié)中結(jié)果顯示，EU1Ⅱ也可以顯著降低血LA含量，但是本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EU1Ⅱ并不能提高LDH活力，即在EU1Ⅱ組中血LA并不是通過LDH活力提高被降低，可能是通過其他途徑或被EU1Ⅱ中其他成分降低。

綜合以上各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，EU1Ⅰ具有更為明顯地延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、降低LA含量、降低SUN含量、提高肝糖原含量、增強(qiáng)LDH活力的能力，即具有明顯的抗疲勞功效。多酚含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EU1Ⅰ中多酚含量要高于EU1Ⅱ，而EU1Ⅰ的抗疲勞功效也較EU1Ⅱ顯著，表明杜仲葉樹脂分離純化產(chǎn)物的抗疲勞功效與多酚含量有關(guān)，推測(cè)多酚物質(zhì)可能為杜仲葉純化產(chǎn)物表現(xiàn)抗疲勞功效的主要功效成分，但尚不清楚是否還與杜仲葉的其他成分有關(guān)，還有待于今后的進(jìn)一步研究，如進(jìn)一步分離純化EU1Ⅰ，以得到純度更高、成分更明確的杜仲葉純化產(chǎn)物，確定杜仲葉抗疲勞功效成分等。

3 結(jié) 論

杜仲葉經(jīng)過大孔吸附樹脂分離純化，得到20%乙醇洗脫溶液(EU1Ⅰ)和60%乙醇洗脫溶液(EU1Ⅱ)，EU1Ⅰ中多酚含量高于EU1Ⅱ。

杜仲葉樹脂分離純化產(chǎn)物表現(xiàn)了一定的抗疲勞功效，并且EU1Ⅰ的抗疲勞功效強(qiáng)于EU1Ⅱ。杜仲葉樹脂分離純化產(chǎn)物的抗疲勞功效與多酚含量有關(guān)，推測(cè)多酚物質(zhì)可能為純化產(chǎn)物表現(xiàn)抗疲勞功效的主要功效成分。

[1] GU Juan, WANG Junjie, YAN Jin, et al. Effects of lignans extracted from Eucommia ulmoides and aldose reductase inhibitor epalrestat on hypertensive vascular remodeling[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011, 133(1)： 6-13.

[2] KWAN C Y, CHEN Changxun, DEYAMA T, et al. Endotheliumdependent vasorelaxant effects of the aqueous extracts of the Eucommia ulmoides Oliv. leaf and bark： implications on their antihypertensive action[J]. Vascular Pharmacology, 2003, 40(5)： 229-235.

[3] LUO Lifang, WU Weihua, ZHOU Yingjun, et al. Antihypertensive effect of Eucommia ulmoides Oliv. extracts in spontaneously hypertensive rats[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 129(2)： 238-243.

[4] KIM H Y, MOON B H, LEE H J, et al. Flavonol glycosides from the leaves of Eucommia ulmoides O. with glycation inhibitory activity[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 93： 227-230.

[5] LEE M K, KIM M J, CHO S Y, et al. Hypoglycemic effect of Duzhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Diabetes Research and Clinical Practice, 2005, 67(1)： 22-28.

[6] HUNG M Y, FU T Y C, SHIH P H, et al. Du-Zhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves inhibits CCl4-induced hepatic damage in rats original research article[J] . Food and Chemical Toxicology, 2006, 44(8)： 1424-1431.

[7] ZHANG R, LIU Z. G, LI C, et al. Du-Zhong (Eucommia ulmoides Oliv.) cortex extract prevent OVX-induced osteoporosis in rats[J]. Bone, 2009, 45： 553-559.

[8] 管淑玉, 蘇薇薇. 杜仲化學(xué)成分與藥理研究進(jìn)展[J]. 中藥材, 2003, 26(2)： 124-129.

[9] 辛?xí)悦? 馮蕾, 王浩, 等. 杜仲的化學(xué)成分及藥理活力研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2007, 13(19)： 1507-1509.

[10] 羅秀陽, 田呈瑞. 杜仲葉保健作用及其在食品加工中的應(yīng)用[J]. 晉東南師范?？茖W(xué)校學(xué)報(bào), 2003, 20(5)： 36-37.

[11] 楊春霞, 翟文俊. 杜仲葉提取物抗疲勞作用研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(9)： 550-552.

[12] 劉麗香, LAURA T L, 梁興飛, 等. Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定苦丁茶中多酚含量[J]. 茶葉科學(xué), 2008, 28(2)： 101-106.

[13] DING Jinfeng, LI Yanyan, XU Jiajie, et al. Study on effect of jellyfish collagen hydrolysate on anti-fatigue and anti-oxidation[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(5)： 1350-1353.

[14] 高珊, 童英, 吳少平, 等. 昆明種小鼠抗疲勞試驗(yàn)中若干參考值測(cè)定[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理, 2001, 18(1)： 16-18.