韓 濤 王一丹 吳國(guó)泰 史玉攀 郭 倩

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

近年來，文獻(xiàn)報(bào)道中藥復(fù)方、單味中藥和中藥有效成分抗肝纖維化取得諸多研究進(jìn)展〔1，2〕。黃芪具有補(bǔ)中益氣之功，在臨床上常用于治療慢性肝病。歷代本草中紅芪記載于黃芪項(xiàng)下，列為上品〔3，4〕，與黃芪的功效相似，多糖為紅芪主要成分之一。本實(shí)驗(yàn)研究紅芪多糖抗大鼠肝纖維化的藥效作用。

1 材料與方法

1.1 藥品 紅芪多糖、黃芪多糖、紅芪水煎液，均由甘肅中醫(yī)學(xué)院藥化實(shí)驗(yàn)室提供。二甲基亞硝胺(DMN)，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑研究所，批號(hào):20110308。大鼠 ALT、AST、HA、LN、Hyp、PCⅢ、Ⅳ-C ELISA試劑盒，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。生理鹽水，購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):C11022108-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 多功能時(shí)間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)，芬蘭wallacVICTOR2 1420研制。80-1型離心機(jī)，上海手術(shù)器械廠生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，雌雄兼用，體重為(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(甘)2004-0006。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組 Wistar大鼠70只，雌雄各半，隨機(jī)分為7組:正常組(A組)、模型組(B組)、紅芪多糖高劑量組(C組)、中劑量組(D組)、低劑量組(E組)、黃芪多糖組(F組)、紅芪水煎液組(G組)，每組10只。

1.4.2 肝纖維化模型 按文獻(xiàn)方法〔5〕，用生理鹽水將DMN稀釋至濃度為0.5%，除正常組外，其余各組大鼠腹腔注射DMN稀釋液1 ml/kg，1 w連續(xù)3 d，1次/d，正常組腹腔注射等劑量生理鹽水，共3 w。

1.4.3 動(dòng)物給藥 用紅芪多糖10 ml/kg(60、30、15 mg/ml)分別對(duì)高、中、低劑量組灌胃給藥，黃芪多糖組灌胃給藥10 ml/kg(30 mg/ml)，紅芪水煎液組灌胃給藥10 ml/kg(0.27 g/ml)，正常組、模型組以等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，共4 w。每3天稱1次大鼠體重，按照大鼠體重增加相應(yīng)的增加給藥量。

1.4.4 標(biāo)本采集 末次給藥后禁食12 h，各組大鼠股動(dòng)脈取血4 ml，放置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)血清生化指標(biāo)。立即脫頸椎處死大鼠，剖腹取肝臟觀察大體外觀后，取肝右葉相同部位0.5 g放入10%多聚甲醛中，HE和Masson染色，取剩余肝臟0.5 g制備10%肝組織勻漿，3 000 r/min，－20℃保存待測(cè)。

1.4.5 指標(biāo)檢測(cè) ELISA法測(cè)定血清ALT、AST，肝組織HA、LN、Hyp、PCⅢ、Ⅳ-C。HE、Masson 染色觀察肝組織變化，檢測(cè)膠原纖維面積百分比(膠原纖維占整屏視野的百分比)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示。采用SPSS14.0軟件統(tǒng)計(jì)運(yùn)算，進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD程序進(jìn)行組間差異分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 DMN染毒期間觀察可見，大鼠生長(zhǎng)減慢，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，飲食減少，糞便稀薄，皮毛皺而不潔，缺乏光澤。給藥治療期，紅芪多糖各組、黃芪多糖組、紅芪水煎液組各項(xiàng)生理體征恢復(fù)較快，其中紅芪多糖高劑量組各項(xiàng)體征恢復(fù)尤為明顯。

2.2 血清ALT、AST含量變化 肝纖維化模型組血清ALT、AST含量明顯升高(P＜0.01)。給藥干預(yù)后，與模型組相比，紅芪多糖各組、黃芪多糖組、紅芪水煎液組血清ALT、AST含量均明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。紅芪多糖中劑量組與黃芪多糖組、紅芪多糖低劑量組與紅芪水煎液組比較均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST含量比較(x ± s，n=10)

2.3 肝組織HA、Hyp、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量變化 與模型組比較，紅芪多糖各組、黃芪多糖組、紅芪水煎液組肝組織HA、Hyp、LN、PCⅢ含量均明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。紅芪多糖高、中劑量組、黃芪多糖組Ⅳ-C含量明顯降低(P＜0.05)。紅芪多糖中劑量組與黃芪多糖組、紅芪多糖低劑量組與紅芪水煎液組比較，均無顯著性差異(P＞0.05)。見表2、表3。

表2 各組大鼠肝組織HA、LN、Hyp含量比較(x ± s，n=10)

表3 各組大鼠肝組織PCⅢ、Ⅳ-C含量及膠原纖維面積比較(x ± s，n=10)

2.4 肝組織病理學(xué)改變

2.4.1 HE染色 ①正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉中央靜脈擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞形態(tài)正常，呈放射狀排列，匯管區(qū)小葉間靜脈擴(kuò)張充血，小葉間動(dòng)脈、膽管形態(tài)正常。②模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂不清，肝小葉中央靜脈擴(kuò)張充血，多數(shù)肝細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)及部分肝血竇疏松化。少數(shù)肝細(xì)胞體大分裂，偶見病理性核分裂像，匯管區(qū)有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，多量纖維結(jié)締組織增生并向肝小葉內(nèi)伸入，并有小膽管增生，此外可見中央靜脈周圍也有不同程度的膠原纖維增生并沿肝竇散在分布，相互連接。③紅芪多糖各組和黃芪多糖組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈及肝內(nèi)小靜脈擴(kuò)張充血，肝索排列整齊，肝細(xì)胞水腫及壞死明顯改善。偶見點(diǎn)狀壞死灶，匯管區(qū)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，極少量纖維組織增生與模型組比較明顯改善，尤以紅芪多糖高劑量組改善顯著。見圖1。

2.4.2 Masson膠原染色 ①正常組僅于匯管區(qū)靜脈血管壁及膽管壁見少許膠原纖維沉積。②于匯管區(qū)及肝細(xì)胞索均見多量膠原纖維沉積。③紅芪多糖各組和黃芪多糖組肝組織纖維膠原均有不同程度改善，膠原纖維受到明顯抑制，肝小葉中央靜脈及匯管區(qū)纖維明顯減少，尤以紅芪多糖高劑量組改善效果明顯。見圖2。

圖1 各組大鼠肝組織切片HE染色(HE，×100)

圖2 各組大鼠肝組織切片Masson染色(Masson，×100)

2.4.3 肝組織膠原纖維面積變化 與模型組比較，紅芪多糖各組、黃芪多糖組、紅芪水煎液組肝組織膠原纖維面積均明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)。紅芪多糖低劑量組與紅芪水煎液組比較有顯著性差異(P＜0.05)。紅芪多糖中劑量組與黃芪多糖組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

3 討論

肝纖維化是肝臟對(duì)慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是慢性肝病的共同病理學(xué)改變。肝纖維化持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化，甚至肝癌〔6，7〕，因此研究肝纖維化的進(jìn)程減緩和逆轉(zhuǎn)是近些年來中醫(yī)肝病研究的熱點(diǎn)之一〔8〕。隨著對(duì)肝纖維化發(fā)生機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深化，現(xiàn)已證實(shí)肝纖維化是可逆性病變〔9〕。近年來中藥抗肝纖維化的研究取得了較大的進(jìn)展，汪少林等〔10〕認(rèn)為肝纖維化的病機(jī)演變是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程。仝欣等〔11〕用黃芪湯活性組分干預(yù)DMN誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠，發(fā)現(xiàn)黃芪總苷和甘草酸是抗肝纖維化的有效成分，可抑制肝纖維化進(jìn)展。周朝暉等〔12〕以甘草酸干預(yù)四氯化碳肝纖維化大鼠模型，2 w后大鼠肝臟炎癥及肝纖維化程度減輕，可能是甘草酸抑制了smad2表達(dá)及上調(diào)smad7，使TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制，阻止了HSC活化。

現(xiàn)代藥理研究紅芪具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能作用，提高特異性和非特異性免疫力，并對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷有一定保護(hù)作用〔13〕。本研究結(jié)果表明紅芪多糖能降低肝纖維化血清ALT、AST水平，有降酶保肝作用。通過酶聯(lián)免疫法檢測(cè)證實(shí)，紅芪多糖對(duì)肝纖維化HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、Hyp水平的升高有明顯抑制作用，并發(fā)現(xiàn)相同劑量的紅芪多糖、黃芪多糖藥效作用相似。病理組織學(xué)觀察結(jié)果，紅芪多糖能明顯抑制膠原的增生，減輕肝纖維化的程度。紅芪多糖具有良好的抗肝纖維化作用，為臨床應(yīng)用紅芪治療肝纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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