梁莉萍 賈存東

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，新疆 烏魯木齊 830011)

癌前病變是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)階段，而在該階段采取積極的治療措施可以延緩甚至逆轉(zhuǎn)癌變的進(jìn)程〔1〕。莪術(shù)油是我國傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀之功效，已被廣泛應(yīng)用于肝癌、大腸癌、胃癌等腫瘤的治療中〔2，3〕。有研究顯示莪術(shù)油對于乳腺癌癌前病變具有良好的治療效果〔3〕，然而其深入的分子機(jī)制尚不清楚。本研究以化學(xué)致癌劑二甲基苯蒽(DMBA)誘導(dǎo)大鼠乳腺癌癌前病變模型，觀察莪術(shù)油作用后，大鼠乳腺癌癌前病變組織病理形態(tài)及P53蛋白的表達(dá)改變。

1 資料與方法

1.1 實驗動物和試劑 選擇健康未育雌性SD大鼠80只，6周齡，清潔級，體重185～235 g，常規(guī)飼養(yǎng)1 w，適應(yīng)環(huán)境后開始實驗。DMBA(Sigma公司，產(chǎn)品編號165023)1 g加入100 ml芝麻油備用;莪術(shù)油注射液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20053467);康萊特注射液(浙江康萊特藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20030004);他莫昔芬(江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H32021472);脫毛膏(廣州市卡梅奧化妝品有限公司，批號:K005041302);即用型SABC試劑盒、DAB二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(上海長島生物技術(shù)有限公司);兔抗人/大/小鼠P53抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);照相顯微鏡:Leica;顯微數(shù)碼攝像圖像采集系統(tǒng):Pixera;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:Thermo。

1.2 造模方法 動物適應(yīng)環(huán)境1 w后，將DMBA 10 mg一次性灌胃后第2天起，按照5 d為1個周期，連續(xù)12個周期。第1～3天，每天腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg，第4天，腹腔注射黃體酮4 mg/kg，停藥1 d。

1.3 分組及給藥方法 分為5組各15只:①空白對照組，一次性灌胃生理鹽水10 ml/kg;第10周開始生理鹽水10 ml/kg腹腔注射，常規(guī)飼養(yǎng)14 w;②疾病模型組，造模結(jié)束后，第10周開始生理鹽水10 ml/kg腹腔注射，常規(guī)飼養(yǎng)14 w;③莪術(shù)油組，造模結(jié)束后，第10周開始莪術(shù)油20 ml/kg腹腔注射，治療4 w;④康萊特組，造模結(jié)束后，第10周開始康萊特20 ml/kg腹腔注射，治療4 w;⑤他莫昔芬組，造模結(jié)束后，第10周開始他莫昔芬20 ml/kg灌胃，治療4 w。

1.4 觀察指標(biāo) 造模結(jié)束后，每日觀察大鼠一般生理情況。實驗結(jié)束前1 d用脫毛劑將大鼠胸部毛發(fā)去除，實驗結(jié)束當(dāng)天以1%戊巴比妥鈉40 ml/kg腹腔注射麻醉后處死大鼠，取胸腹部第3、4、5對乳腺及其周圍皮膚，皮下組織，經(jīng)中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水后石蠟包埋切片，分成2份，1份經(jīng)HE染色，光鏡觀察乳腺組織學(xué)情況，大鼠乳腺組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2003年AHO制定的分類標(biāo)準(zhǔn)〔4〕。另1份石蠟包埋組織切片采用SP二步法行免疫組織化學(xué)染色，檢測P53蛋白表達(dá)情況。將獲取的標(biāo)本進(jìn)行抗原修復(fù)，然后滴加3%過氧化酶阻斷劑室溫反應(yīng)10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性。加一抗4℃冰箱過夜，依次加入生物素標(biāo)記的二抗及SABC試劑，然后進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明封片。具體步驟參照即用型快捷免疫組化SABC試劑盒(鼠/兔)說明書。以PBS液代替一抗作為陰性對照，以已知陽性表達(dá)的宮頸癌標(biāo)本作為陽性對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS10.0軟件，數(shù)據(jù)用x±s表示，采用單因素方差分析，率的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況 大鼠DMBA灌胃2 w后各組均陸續(xù)出現(xiàn)死亡。至試驗結(jié)束時，空白對照組存活15只，疾病模型組，莪術(shù)油組和康萊特組各10只，他莫昔芬組9只，空白組死亡率顯著低于其他組別(P＜0.05)。

2.2 大鼠試驗后乳房病理學(xué)情況 疾病模型組與空白對照組在大鼠乳腺組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)比上存在顯著差異，前者出現(xiàn)癌前病變形態(tài)的比例更高(P＜0.05)。莪術(shù)油、康萊特及他莫昔芬乳腺癌癌前病變及浸潤癌出現(xiàn)率均較疾病模型組低(P＜0.05)。其中，莪術(shù)油組乳腺癌癌前病變及浸潤癌顯著低于他莫昔芬組及康萊特組。見表1。

2.3 不同組別大鼠乳腺組織P53與Ki-67蛋白表達(dá)情況P53、Ki-67蛋白的表達(dá)主要在細(xì)胞核中，呈黃色或棕黃色?？瞻讓φ战M大鼠乳腺組織中均未見P53、Ki-67蛋白表達(dá)。疾病模型組P53、Ki-67蛋白顯著高于其他組別(P＜0.05)，莪術(shù)油、康萊特及他莫昔芬組P53、Ki-67表達(dá)水平無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠乳房病理學(xué)情況〔n(%)，n=15〕

表2 各組大鼠乳腺組織P53與Ki-67基因表達(dá)情況〔n(%)，n=15〕

3 討論

流行病學(xué)研究結(jié)果表明，乳腺癌的發(fā)生是一個多階段的模式，即“經(jīng)乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞一般增生-非典型增生-原位癌-浸潤性癌變”的逐漸演變過程，在癌前病變期，即浸潤性癌前階段采取積極的干預(yù)措施可及時截斷甚至逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展進(jìn)程，取得滿意的治療效果〔1〕。遺憾的是，目前針對乳腺癌癌前病變尚無特異性的治療藥物，西藥治療往往具有較大的副作用，而中醫(yī)藥由于其安全、高效，個性化優(yōu)勢，在乳腺癌癌前病變的治療中獲得越來越多的關(guān)注。莪術(shù)油為傳統(tǒng)中藥莪術(shù)根莖中提取的揮發(fā)油，其主要活性成分為莪術(shù)醇和蓬術(shù)環(huán)氧酮、蓬莪術(shù)酮、蓬莪術(shù)環(huán)二烯等倍半倍萜類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗血管生成、抗病毒、抗菌、抗炎等作用。宋愛莉等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油可改善乳腺癌癌前病變造模大鼠的血液流變學(xué)，增加乳房的微循環(huán)灌注量，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。此外，殷玉坤等〔5〕對莪術(shù)油在乳腺癌癌前病變的應(yīng)用進(jìn)行了大量研究，均證實其可有效抑制乳腺癌的繼續(xù)發(fā)展。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實了莪術(shù)油治療乳腺癌癌前病變的確切療效。

P53基因定位于人17號染色體(17p13.1)，包括11個外顯子和10個內(nèi)含子，是最受矚目的抑癌基因。野生型P53蛋白半衰期短，積聚水平低，不宜測出，而突變型P53蛋白半衰期長，穩(wěn)定性強(qiáng)，可用免疫組化方法檢測到〔6〕。殷玉坤等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)P53基因突變與乳腺癌的惡性程度相關(guān)。本研究顯示莪術(shù)油治療后，大鼠乳腺組織中P53蛋白表達(dá)降低，這可能是由于莪術(shù)油可降解突變型P53，甚至將其逆轉(zhuǎn)為野生型P53。惡性腫瘤的基本特征之一是腫瘤細(xì)胞無限增殖，Ki-67表達(dá)在所有活動的細(xì)胞周期(G1，S，G2和有絲分裂期)，被認(rèn)為是評價腫瘤細(xì)胞增殖程度的良好指標(biāo)〔7〕。本研究顯示莪術(shù)油可顯著抑制Ki-67的表達(dá)，與國外研究〔8〕一致。

綜上所述，莪術(shù)油可以顯著延緩大鼠乳腺癌癌前病變的發(fā)生發(fā)展，抑癌基因P53與原癌基因Ki-67可能與其抑癌作用機(jī)制密切相關(guān)，因而可作為分子標(biāo)志物用于臨床乳腺癌癌前病變的診斷和治療。

1 王 峰，馬忠兵，方允治，等.乳腺癌癌前病變大鼠模型的建立〔J〕.中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2009;12(5):387-10.

2 劉曉菲，宋愛莉，李靜蔚，等.莪術(shù)油對大鼠乳腺癌癌前病變MVD及相關(guān)調(diào)控因子VEGF/FLK表達(dá)的干預(yù)作用研究〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報，2011;39(4):212-5.

3 宋愛莉，張敬濤，李靜蔚，等.莪術(shù)油對乳腺癌癌前病變造模大鼠血液流變學(xué)及乳房微循環(huán)的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008;26(3):458-60.

4 B¨ocker W.WHO classification of breast tumors and tumors of the female genital organs:pathology and genetics〔J〕.Verh Dtsch Ges Pathol.2002;86:116-9.

5 殷玉坤，宋愛莉，李靜蔚，等.莪術(shù)油對大鼠乳腺癌前病變組織中C-erbB-2，P53表達(dá)的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012;30(6):1219-2.

6 王洪濱，張學(xué)新，蘇 君，等.P53、Ki-67在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義〔J〕.中國誤診學(xué)雜志，2011;11(34):8361.

7 孫明霞，夢雅萍，張軍力，等.Ki-67抗原在臨床疾病中的研究進(jìn)展〔J〕.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2009;41(11):1336-7.

8 Karmakar I，Dolai N，Suresh Kumar RB，et al.Antitumor activity and antioxidant property of Curcuma caesia against Ehrlich's ascites carcinoma bearing mice〔J〕.Pharm Biol，2013;51(6):753-9.