趙大顯，陳敏文，江 坤，吳小平*

(1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330031;2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330031)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國(guó)重要增養(yǎng)殖對(duì)象之一，近年來(lái)，由細(xì)菌、病毒和類(lèi)立克次體生物等引起的各種疾病日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了我國(guó)蟹類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。而目前蟹病主要采用抗生素等藥物進(jìn)行防治，這無(wú)形中也對(duì)病原菌進(jìn)行了耐藥性篩選，促成了病原菌的基因變異，提高了它們的抗藥性，從而有惡性循環(huán)的潛在可能。因此，研究中華絨螯蟹的免疫機(jī)制，有效提高蟹類(lèi)本身的抗病能力，越來(lái)越受到人們的重視。國(guó)內(nèi)學(xué)者先后從生理生化水平對(duì)中華絨螯蟹免疫防御機(jī)制進(jìn)行了探討[1－4]，近年來(lái)，又逐漸向分子水平深入，獲得了一些與免疫相關(guān)的表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)和基因序列[5－8]。這些研究將有助于更好的了解中華絨螯蟹和病原之間的關(guān)系，也為今后研究該物種的抗病分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

嗜水氣單胞菌(Aeromonaz hydrophila)作為一種重要的人－獸－魚(yú)共患病病原，在自然界分布廣泛，可以感染多種水生及陸生動(dòng)物并引起不同的疾病，給人類(lèi)的健康帶來(lái)威脅同時(shí)也給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成慘重的經(jīng)濟(jì)損失，危害性極大。Zhu[9]從患病瀕死的中華絨螯蟹肝胰腺中分離到3株嗜水氣單胞菌也均能引起健康蟹的死亡，從而發(fā)現(xiàn)該菌也是引起中華絨螯蟹患病的重要病原之一。

抑制性消減雜交技術(shù)(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的分離、克隆差異基因的技術(shù)，該技術(shù)具有假陽(yáng)性率低、篩選效率高、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，能有效地分離擴(kuò)增低豐度差異表達(dá)的基因[10]。本研究利用該技術(shù)，成功構(gòu)建了嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)下中華絨螯蟹差異表達(dá)基因的cDNA文庫(kù)，并對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步開(kāi)展該物種抗病相關(guān)基因的篩選、克隆和功能分析奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為中華絨螯蟹大規(guī)模細(xì)菌性疾病的檢測(cè)、控制提供了有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)菌株 中華絨螯蟹成體(50～100 g)購(gòu)于南昌市墩子塘水產(chǎn)市場(chǎng)，于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一周后選取健康、活潑且四肢健全的蟹用于試驗(yàn)。嗜水氣單胞菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 感染與血淋巴細(xì)胞收集 在感染組中，中華絨螯蟹體側(cè)肌肉注射0.1 mL 7.2×108 CFU/mL嗜水氣單胞菌[8]，同時(shí)對(duì)照組注射0.1 mL無(wú)菌生理鹽水。在12 h內(nèi)連續(xù)觀察，待中華絨螯蟹出現(xiàn)個(gè)體明顯活動(dòng)異?；騻€(gè)別死亡時(shí)抽取血淋巴，4℃，12 000 r/min離心10 min，收集血淋巴細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA抽提和mRNA的分離 于血淋巴細(xì)胞中按0.1 g/mL加入Trizol Reagent(Invitrogen)，振蕩混勻，加入等體積的氯仿，蓋緊蓋子，顛倒搖動(dòng)15 s，室溫放置2～3 min;4℃，13 000 r/min離心20 min，取上清，移至新的EP管中;向EP管中加入0.8倍體積的異丙醇，混勻，－20℃沉淀1 h，4℃，13 000 r/min離心20 min;棄上清，加入75%乙醇洗滌，溶于一定體積的DEPC水中。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，根據(jù)其濃度，取約150 ng進(jìn)行凝膠電泳分析，觀察是否被降解;在確定該總RNA未被污染的前提下，取約600 μg的總RNA，按Oligotex mRNA Kit的方法分離mRNA。取1 μL獲得的mRNA用于凝膠電泳，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280的比值，取約0.5 μg用于合成cDNA。

1.2.2 抑制性消減雜交 采用Clontech公司提供的PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit進(jìn)行抑制性消減雜交，具體操作步驟參照試劑盒的操作手冊(cè)。其中正向雜交以嗜水氣單胞菌感染后的中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞mRNA為tester，以生理鹽水處理的中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞mRNA為driver;反向雜交以生理鹽水處理的中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞mRNA為tester，經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后的中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞mRNA 為 driver。

1.2.3 消減效率的檢測(cè) 用中華絨螯蟹β－actin特異的上游引物:5'－GCATCCACGAGACCACTT ACA－3'，下游引物:5'－CTCCTGCTTGCTGATCCACATC－3'，對(duì)消減后第2次PCR產(chǎn)物進(jìn)行消減效率分析。同時(shí)，以未經(jīng)消減雜交的cDNA(在制備Tester cDNA連接2種接頭時(shí)，將剛好加樣還未進(jìn)行連接反應(yīng)的Tester1－1 cDNA和Tester1－2 cDNA各取2:l混合，進(jìn)行連接反應(yīng)完成)作為對(duì)照進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃，30 s;60℃，30 s;72℃，1 min擴(kuò)增，33個(gè)循環(huán)，分別在第18、23、28、33循環(huán)處各取5 μL進(jìn)行電泳，檢測(cè)消減效率。

1.2.4 消減文庫(kù)的構(gòu)建及檢測(cè) 將第2次PCR的產(chǎn)物連接到Promega公司提供的載體pGEM-T easy，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素和藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆。隨機(jī)挑取15個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物為Nesetd PCR Primer l和Nested PCR Primer 2R。隨機(jī)從文庫(kù)中挑取54個(gè)陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。

1.2.5 序列分析與同源性比對(duì) 利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去除載體及接頭序列、剔除重復(fù)序列分析，獲得部分差異表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)，將獲得的ESTs序列提交到NCBI使用BLASTn進(jìn)行序列相似性搜素，并初步推斷差異表達(dá)基因的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA電泳鑒定

提取的感染組和對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，總RNA以18 S條帶為主，未見(jiàn)彌散現(xiàn)象，說(shuō)明總RNA未發(fā)生降解(圖1)，達(dá)到了構(gòu)建文庫(kù)要求。

圖1 中華絨螯蟹總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of Eriocheir sinensis total RNA

圖2 雙鏈cDNA電泳圖Fig.2 Electrophoresis of Eriocheir sinensis cDNA

2.2 SMART cDNA 合成

提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成第一、第二鏈cDNA，獲得雙鏈cDNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，雙鏈cDNA為彌散狀條帶，片段大小均大于0.1 kb(圖2)，符合試驗(yàn)要求。

2.3 Rsa I酶切

對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行酶切后電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶切后的片段明顯較未經(jīng)酶切片段減小(圖3)，說(shuō)明酶切效果較好，可以進(jìn)行下一步cDNA接頭的連接。

2.4 接頭連接效率分析

雙鏈cDNA與接頭連接效率的高低是決定抑制性消減雜交成敗非常關(guān)鍵的一步。利用中華絨螯蟹管家基因β－actin上下游特異性引物以及試劑盒所帶的3'端特異性引物與PCR primer 1對(duì)兩組分別連接有接頭1和接頭2的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，管家基因的3'端特異引物與接頭的外側(cè)引物primer 1組合的擴(kuò)增片段大于管家基因3'、5'端特異引物組合的擴(kuò)增片段，且以β－actin內(nèi)部特異引物和接頭引物組成的引物組擴(kuò)增產(chǎn)物亮度超過(guò)以β－actin 2個(gè)特異引物為引物組擴(kuò)增產(chǎn)物亮度的1/4(圖4)，說(shuō)明連接效果較好，接頭的連接效率至少達(dá)到25%，可以用于消減雜交。

2.5 第一輪PCR

用接頭序列的外側(cè)引物對(duì)消減雜交產(chǎn)物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，30個(gè)循環(huán)后，正向和反向消減雜交產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物均呈彌散狀條帶(圖5)。

圖3 Rsa I酶切分析Fig.3 Reverse transcription cDNA of Eriocheir sinensis after Rsa I digestion and not Rsa I digestion

圖4 接頭連接效率檢測(cè)Fig.4 Test of adaptors ligation efficiency

圖5 消減產(chǎn)物第一輪PCRFig.5 The first PCR result of subtractive hybridization product

圖6 消減產(chǎn)物第二輪PCRFig.6 The second PCR result of subtractive hybridization product

2.6 第二輪PCR

用接頭序列的內(nèi)側(cè)引物對(duì)第一輪PCR稀釋產(chǎn)物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增(巢式PCR)，15個(gè)循環(huán)后發(fā)現(xiàn)，第二輪PCR產(chǎn)物為0.2～1.5 kb之間的大小不一條帶(圖6)。

2.7 消減文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)

將第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM－T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行消減cDNA質(zhì)粒文庫(kù)的構(gòu)建。隨機(jī)從文庫(kù)挑取15個(gè)陽(yáng)性克隆，以Nesetd PCR Primer l和Nested PCR Primer 2R為引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，插入cDNA片斷的大小主要集中在100～1 000 bp之間(圖7)，表明所構(gòu)建文庫(kù)質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)的測(cè)序分析。

圖7 菌落PCR檢測(cè)消減cDNA文庫(kù)克隆插入片段大小Fig.7 Identification of the inserted cDNA fragment in subtractive cDNA library by PCR

2.8 差異表達(dá)的EST序列分析

將54個(gè)陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAMAN軟件分析，獲得37條EST序列。將獲得序列提交到NCBI選擇BLASTn進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，有6條ESTs與其他物種的免疫基因序列具有較高的同源性(表1)，說(shuō)明所構(gòu)建的文庫(kù)達(dá)到了富集抗病相關(guān)基因的目的，可用于下一步免疫相關(guān)基因的篩選和功能分析。

表1 免疫相關(guān)的差異表達(dá)片段BLAST同源性比對(duì)結(jié)果Tab.1 BLAST analysis result of differentially expressed immune-related segments

3 討論

起始總RNA和mRNA的質(zhì)量和完整性是差異表達(dá)cDNA文庫(kù)能否成功構(gòu)建的關(guān)鍵步驟之一。從圖1可見(jiàn)，本試驗(yàn)所提取的血淋巴細(xì)胞總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有18 S、28 S和5 S三條清晰的條帶，說(shuō)明提取的總RNA具有很好的完整性。一般認(rèn)為，在真核生物中，總RNA在正常情況下28 S rRNA的亮度約為18 S rRNA的兩倍[11]，但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，28 S rRNA的亮度低于18 S rRNA，這種現(xiàn)象在中國(guó)對(duì)蝦[12]和凡納濱對(duì)蝦[13]中也存在。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能有四點(diǎn):一是試驗(yàn)過(guò)程中有部分28 S rRNA被降解;二是中華絨螯蟹總RNA的28 S rRNA比18 S rRNA少;三是RNA在電泳過(guò)程中28 S rRNA更易形成二級(jí)結(jié)構(gòu);四是不同物種間總RNA的28 S rRNA和18 S rRNA比例不同所致[13]。另外，在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程，從反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及RasⅠ酶切檢測(cè)、加接頭連接效率到消減cDNA片段的消減效率分析等每個(gè)環(huán)節(jié)都進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，保證每步獲得的結(jié)果達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)的要求，確保獲得高質(zhì)量的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)。從菌落PCR擴(kuò)增及陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果可以看出，所獲得的陽(yáng)性克隆片段大小具有很好的多態(tài)性，同時(shí)一些與抗病相關(guān)的基因得到了富集。

通過(guò)進(jìn)一步對(duì)隨機(jī)挑取的54個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，有6條EST序列與免疫相關(guān)。其中，Hem 01與油橄欖(Olea europaea)類(lèi)甜蛋白(Thaumatin-like protein，TLP)基因序列相似性達(dá)到100%，該基因已被證實(shí)具有顯著的抗真菌活性，一些轉(zhuǎn)TLPs基因的植物對(duì)于真菌性病害的抗性也顯著增強(qiáng)[15]。Hem 02與栽培蘋(píng)果(Malus domestica)金屬硫蛋白(metallothionein，MT)基因序列相似性為100%，已有研究表明，該基因在中華絨螯蟹先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能[16]。作為先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是生物的一種模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)，它主要通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)來(lái)啟動(dòng)免疫反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)TLRs在炎癥、細(xì)胞凋亡、腫瘤等發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色，同時(shí)具有介導(dǎo)抗真菌感染信號(hào)轉(zhuǎn)到的功能。本研究從文庫(kù)中篩選的Toll樣受體(Hem 03)及已報(bào)道的從中華絨螯蟹cDNA文庫(kù)中獲得的該基因EST序列[5]表明，Toll樣受體在該物種抗病過(guò)程中具有重要的功能，對(duì)該基因的進(jìn)一步研究將有助于更深入的了解中華絨螯蟹的免疫應(yīng)答機(jī)制。Crustin是一類(lèi)具有廣譜抗菌活性的抗菌肽，研究表明，Crustin普遍存在于甲殼動(dòng)物(蟹、對(duì)蝦、龍蝦、螯蝦等)血淋巴中，對(duì)細(xì)菌和真菌均有抗菌活性[17－18]。本研究篩選到的該基因(Hem 04)與大西洋小龍蝦(Nephrops norvegicus)相似性為97%，且該基因已被證實(shí)參與了中華絨螯蟹的先天免疫應(yīng)答反應(yīng)[19]。另外，有研究表明，從文庫(kù)中篩選獲得的組織蛋白酶基因(Hem 04)也與中華絨螯蟹抗病相關(guān)[20]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)是多種免疫細(xì)胞的骨泌或旁分泌調(diào)節(jié)因子，在特異性抗原等刺激下，核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞被激活，產(chǎn)生并釋放TGF。這些免痤細(xì)胞都有TGF受體，激活后所釋放的TGF以自分泌或旁分泌方式反饋?zhàn)饔糜谶@些細(xì)胞。幾乎所有的正常細(xì)胞表面都有TGF受體，現(xiàn)已知有三種高親和性的細(xì)胞膜受體，稱(chēng)為I型、Ⅱ型和Ⅲ型受體。其中，I型受體是糖蛋白，是一種跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要介導(dǎo)TGF對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。本研究篩選到的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體基因(Hem 06)將有助于進(jìn)一步了解中華絨螯蟹免疫信號(hào)識(shí)別及傳遞途徑和機(jī)制。

以上結(jié)果表明，本研究獲得了中華絨螯蟹高質(zhì)量的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)，可用于后續(xù)大規(guī)模測(cè)序及EST分析，并且可以從該文庫(kù)中篩選出一些差異表達(dá)的與免疫相關(guān)的基因序列。對(duì)這些基因序列可進(jìn)一步通過(guò)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行基因全長(zhǎng)擴(kuò)增，并對(duì)其功能進(jìn)行研究，為闡述中華絨螯蟹先天免疫反應(yīng)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

[1]宋林生，季延賓，蔡中華，等.溫度驟升對(duì)中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)幾種免疫化學(xué)指標(biāo)的影響[J].海洋與湖沼，2004，35(1):74 －77.

[2]艾春香，陳立僑，高露姣，等.VC對(duì)河蟹血清和組織中超氧化物歧化酶及磷酸酶活性的影響[J].臺(tái)灣海峽，2002，21(4):431－438.

[3]馬貴華，鐘青，曹義虎，等.中華絨螯蟹酚氧化酶的初步研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18(1):41－44.

[4]沈錦玉，錢(qián)冬.中華絨螯蟹病毒病原的初步研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，19(5):487－489.

[5]Gai Y C，Wang L L，Zhao J M，et al.The construction of a cDNA library enriched for immune genes and the analysis of 7535 ESTs from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis[J].Fish and Shellfish Immunology，2009，27(6):684 －694.

[6]Mu C K，Zhao J M，Wang L L，et al.A thioredoxin with antioxidant activity identified from Eriocheir sinensis[J].Fish and Shellfish Immunology，2009，26(5):716 －723.

[7]Qin C J，Chen L Q，Qin J G，et al.Characterization of a serine proteinase homologous(SPH)in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis[J].Developmental and Comparative Immunology，2010，34(1):14 －18.

[8]Zhao D X，Chen L Q，Qin C J，Zhang H，Wu P，Zhang F Y.A delta-class glutathione transferase from the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis:cDNA cloning，characterization and mRNA expression[J].Fish and Shellfish Immunology，2010，29(4):698－703.

[9]Zhu Y X，Cao G L，Xue R Y，et al.The identification and characteristic of Aeromonas hydrophila from Eriocheir sinensis[J].Journal of Suzhou University(Natural Science)，2002，18(3):100 －106.

[10]Diatchenko L，Lau Y F，Campbell A P，et a1.Suppression subtraction hybridization:a method for generating differentially regulated or tissue specific cDNA probes and libraries[J].Proc Nail Acad Sci USA，1996，93(12):6025 － 6030.

[11]王在照，焦傳珍，張曉軍，等.中國(guó)對(duì)蝦蛻皮抑制激素全長(zhǎng)cDNA的克隆及序列分析[J].遺傳學(xué)報(bào)，2003，30(2):128－134.

[12]Wang B，Li F H，Dong B，et al.Discovery of the genes in response to white spot syndrome virus(WSSV)infection in Fenneropenaeus chinensis through cDNA microarray[J].Marine Biotechnology，2006，8(5):491 －500.

[13]蔡小輝，魯義善，吳灶和，等.溶藻弧菌誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦消減文庫(kù)的構(gòu)建及其表達(dá)序列標(biāo)簽分析[J].水生生物學(xué)報(bào)，2010，34(1):157 －163.

[14]賈錫偉，王藝?yán)?，張子平，?利用SMART技術(shù)構(gòu)建鋸緣青蟹精巢和卵巢的cDNA文庫(kù)[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，43(4):547 －550.

[15]Zhu B L，Chen T H，Li P H.Analysis of late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for an osmotin-like protein[J].Planta，1996，198(1):70 －77.

[16]Ren F，Jiang H，Sun J L，et al.Cloning，characterization，expression，and copper sensitivity of the metallothionein-1 gene in the Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis[J].Molecular Biology Reports，2011，38(4):2383 －2393.

[17]Relf J M，Chisholm J R，Kemp G D，et al.Purification and characterization of a cysteinerich 11.5 kDa antibacterial peptide from the granular haemocytes of the shore crab，Carcinus maenas[J].European Journal of Biochemistry，1999，264(2):350 －357.

[18]Smith V J，F(xiàn)ernandes JMO，Kemp G D，et al.Crustins:enigmatic WAP domain-containing antibacterial proteins from crustaceans[J].Developmental and Comparative Immunology，2008，32(7):758 －772.

[19]Mu C K，Zheng P L，Zhao J M，et al.Molecular characterization and expression of a crustin － like gene from Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis[J].Developmental and Comparative Immunology，2010，34(7):734 －740.

[20]Li W W，Jin X K，He L，et al.Molecular cloning ，characterization and expression analysis of cathepsin C gene involved in the antibacterial response in Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis[J].Developmental and Comparative Immunology，2010，34(11):1170－1174.

[21]李京紅.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，1998(1):28－30.