馬曉莉， 劉晉芝， 曹松云， 王 淼， 張新穎

(河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000)

瑞香狼毒為瑞香科狼毒屬植物Stellera chamaejasmeL.的干燥根，其味苦、辛，性平，有毒，入肝、肺、脾三經(jīng)，有逐水、祛痰、破積、殺蟲之功效［1］。瑞香狼毒用于治療腫瘤在我國(guó)已有悠久的歷史。諸多文獻(xiàn)報(bào)道生藥狼毒既有明顯的體外抗腫瘤作用［2］，又具有非常強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤作用［3］，其含藥血清也有明顯的抗腫瘤作用［4］。但瑞香狼毒全草有毒，特別是對(duì)胸腺、脾臟等重要器官毒副作用較大。蒙醫(yī)在防病、治病的實(shí)踐中，摸索出狼毒的多種炮制方法，以達(dá)到減毒增效的目的，其中酒制狼毒有抗腫瘤作用，但炮制機(jī)理研究較少。本文通過(guò)H22荷瘤小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，考察了酒制對(duì)瑞香狼毒抑瘤作用的影響，探討其抑瘤機(jī)制，為瑞香狼毒的進(jìn)一步開發(fā)、應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 狼毒購(gòu)自安國(guó)市昌達(dá)中藥材飲片有限公司，留300 g作為生藥狼毒組的用藥;酒制狼毒的制備:另外取300 g狼毒飲片，制備酒制狼毒，加60°白酒 (紅星二鍋頭，北京紅星公司產(chǎn)品)沒過(guò)狼毒，浸泡6 h后，用文火煮至白酒完全被狼毒吸收，60℃烘干。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量 (20±2)g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)1112090。瘤株為H22小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株，由河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物免疫實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.3 動(dòng)物處理與分組 先從80只小鼠中隨機(jī)取10只不接種腫瘤，作為空白對(duì)照組;余下的70只接種腫瘤。取接種6 d腫瘤生長(zhǎng)良好的小鼠腹水，用生理鹽水稀釋成1×106/mL，以每只0.2 mL的量接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，接種后24 h隨機(jī)分為7組，第一組為腫瘤對(duì)照組，其余6組為治療組，即生藥狼毒低、中、高劑量組 (低、中、高劑量分別為5、10、20 g/kg體質(zhì)量的生藥狼毒藥液)，酒制狼毒低、中、高劑量組 (低、中、高劑量分別為5、10、20 g/kg體質(zhì)量的酒制狼毒藥液)，空白對(duì)照組和腫瘤對(duì)照組給20 g/kg體質(zhì)量的生理鹽水。接種24 h后開始灌胃1 mL，每天1次連續(xù)8 d。于停藥后次日處死小鼠，稱體質(zhì)量解剖皮下瘤塊，取脾臟和胸腺，分別再稱定質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率和脾、胸腺指數(shù)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 體質(zhì)量增長(zhǎng) 將腫瘤對(duì)照組、狼毒生藥對(duì)照組和酒制狼毒低、中、高劑量各組小鼠在接種腫瘤后24 h稱取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量，并以苦味酸作標(biāo)記，末次給藥后24 h再次稱取體質(zhì)量并減去瘤質(zhì)量，兩次體質(zhì)量差即為體質(zhì)量增長(zhǎng)指標(biāo)。

1.4.2 抑瘤率 按1978年全國(guó)抗癌藥物研究協(xié)會(huì)制定的《抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選規(guī)程》判定腫瘤抑制率［5］。將狼毒生藥組和酒制狼毒低、中、高劑量各組小鼠末次給藥后24 h處死動(dòng)物，剝離瘤體電子天平稱定質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。

1.4.3 脾指數(shù)的測(cè)定 將所有各組小鼠采用稱重法將小鼠稱定質(zhì)量后脫頸處死，剝離脾臟，電子天平稱定質(zhì)量，計(jì)算脾指數(shù) (mg/g)。

1.4.4 胸腺指數(shù)的測(cè)定 將所有各組小鼠采用稱重法將小鼠稱定質(zhì)量后脫頸處死，剝離胸腺，電子天平稱定質(zhì)量，計(jì)算脾指數(shù) (mg/g)。

1.4.5 Bax、Bcl-2免疫組織化學(xué)染色 將生藥狼毒組和酒制低、中、高劑量組小鼠脫頸椎處死后很快取出腫瘤，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、包埋成石蠟切片，每張均切4 μm薄的切片，準(zhǔn)備做免疫組化。免疫組化步驟:石蠟切片，60℃烤箱烤片20 min后，二甲苯脫蠟、不同濃度酒精脫水，3%H2O2去離子水孵育30 min，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)微波修復(fù);自然冷卻至室溫;分別用兔抗鼠Bax和Bcl-2抗體 (Santa cruz，1∶100)孵育切片 (4℃，過(guò)夜);滴加試劑1，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育20 min;滴加試劑2，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育20 min;DAB避光顯色1至2 min。每步驟間用0.01 mol/L PBS充分洗滌，再經(jīng)過(guò)石蠟切片的常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍攝照片。對(duì)照試驗(yàn):省去一抗或用PBS代替一抗孵育切片，結(jié)果為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 使用醫(yī)學(xué)圖像分析儀 (TN-8502)，鏡下觀察狼毒生藥組和酒制狼毒低、中、高劑量各組染色結(jié)果，并測(cè)定細(xì)胞灰度值，用該儀器自帶分析軟件分析相應(yīng)抗體的表達(dá)量。以上四組每組取五張切片，每張切片選五個(gè)視野，計(jì)算其平均值即為該張切片的灰度值，五張切片的平均值為該組的灰度值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 酒制狼毒各組對(duì)抑瘤率的影響 生藥狼毒對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，20 g/kg體質(zhì)量生藥狼毒灌胃抑瘤作用最好，抑瘤率為69.45%，5、10 g/kg生藥狼毒抑瘤率為46.78%、52.34%。經(jīng)過(guò)用白酒炮制后狼毒對(duì)腫瘤的抑制作用明顯增強(qiáng)，酒制狼毒低、中劑量組的抑瘤率分別高達(dá)98.40%、87.16%，高劑量酒制狼毒對(duì)腫瘤的抑制和生藥狼毒比有所下降，抑瘤率為50.21%。見表1。

表1 生藥狼毒和各組酒制狼毒對(duì)H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of tumor inhibition of liquor-saturated Stellera chamaejasme and crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

表1 生藥狼毒和各組酒制狼毒對(duì)H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of tumor inhibition of liquor-saturated Stellera chamaejasme and crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

注:與腫瘤對(duì)照組比較，▲P＜0.05;與生藥狼毒高劑量組比較，■P＜0.05。

組 別 瘤質(zhì)量/g 抑瘤率/%腫瘤對(duì)照組0.655 6±0.416 9 －生藥狼毒低劑量組 0.545 0±0.396 6▲ 46.78生藥狼毒中劑量組 0.418 9±0.527 8▲ 52.34生藥狼毒高劑量組 0.200 3±0.176 4▲ 69.45酒制狼毒低劑量組 0.010 5±0.011 2▲■ 98.40酒制狼毒中劑量組 0.084 2±0.101 4▲■ 87.16酒制狼毒高劑量組 0.326 4±0.366 2▲50.21

2.2 酒制狼毒各組對(duì)體質(zhì)量增長(zhǎng)、脾臟和胸腺的影響 與空白對(duì)照組比較，生藥狼毒組和酒制狼毒低、中、高劑量組的體質(zhì)量增長(zhǎng)均P＞0.05，無(wú)明顯變化;與空白對(duì)照組比較，酒制狼毒低、中、高劑量各組對(duì)脾臟、胸腺的毒副作用小，脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均P＞0.05;生藥狼毒組對(duì)脾臟、胸腺影響較大，與空白對(duì)照組比較脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均P＜0.05;與生藥狼毒組比較，酒制狼毒低、中、高劑量各組的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均P＜0.05。見表2。

2.3 生藥狼毒和各組酒制狼毒對(duì)Bax及Bcl-2表達(dá)的影響 與生藥狼毒組比較，酒制狼毒各組明顯使Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表2 生藥狼毒和各組酒制狼毒對(duì)H22荷瘤小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 (±s，n=10)Tab.2 Effect of body weight，thymus index，spleen index in liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

表2 生藥狼毒和各組酒制狼毒對(duì)H22荷瘤小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 (±s，n=10)Tab.2 Effect of body weight，thymus index，spleen index in liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme on H22tumor-bearing mice(±s，n=10)

注:與空白對(duì)照組比較，■P＜0.05，與生藥狼毒組比較，▲P＜0.05。

脾指數(shù) 胸腺指數(shù)空白對(duì)照組組 別 體質(zhì)量增長(zhǎng)值/g 3.970 0±1.314 9 0.452 6±0.116 9 0.257 4±0.072 5腫瘤對(duì)照組 3.554 4±2.158 1 0.403 0±0.107 4 0.228 3±0.059 1生藥狼毒組 4.259 6±2.120 3 0.213 4±0.150 9■ 0.109 3±0.084 7■酒制狼毒低劑量組 4.269 4±2.058 4 0.482 0±0.103 6▲ 0.279 6±0.435 0▲酒制狼毒中劑量組 4.705 8±1.178 4 0.475 6±0.151 0▲ 0.264 5±0.055 8▲酒制狼毒高劑量組 2.929 1±0.993 3 0.413 6±0.117 4▲ 0.253 8±0.070 5▲

表3 Bax、Bcl-2在各組酒制法狼毒和生藥狼毒組中表達(dá)的比較 (±s)Tab.3 Comparison of Bax and Bcl-2 on liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme(±s)

表3 Bax、Bcl-2在各組酒制法狼毒和生藥狼毒組中表達(dá)的比較 (±s)Tab.3 Comparison of Bax and Bcl-2 on liquor-saturated Stellera chamaejasme and groups of crude Stellera chamaejasme(±s)

注:與生藥狼毒組比較，■P＜0.05;與腫瘤對(duì)照組比較，▲P＜0.05。

組 別 測(cè)量視野數(shù)Bax Bcl-2生藥狼毒組 25 10.31±2.26▲ 31.24±2.58▲腫瘤對(duì)照組 25 6.23±2.18 42.38±1.86酒制狼毒低劑量組 25 28.69±2.63■▲ 12.13±2.32■▲酒制狼毒中劑量組 25 26.75±1.78■▲ 17.36±1.92■▲酒制狼毒高劑量組 25 22.31±3.27■▲ 20.45±2.76■▲

取生藥狼毒組和酒制狼毒低、中、高劑量組的腫瘤，做免疫組化常規(guī)DAB顯色，Bax表達(dá)陽(yáng)性的為細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒，與腫瘤對(duì)照組比較，生藥狼毒和酒制狼毒棕黃色顆粒都有增加;與生藥狼毒組比較，酒制毒低、中劑量棕黃色顆粒增加較多，高劑量增加較少 (見圖1)。

取生藥狼毒組和酒制狼毒低、中、高劑量組的腫瘤，做免疫組化常規(guī)DAB顯色，Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性的為細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒，與腫瘤對(duì)照組比較，生藥狼毒組和酒制狼毒棕黃色顆粒減少;與生藥狼毒組比較，酒制狼毒低、中劑量棕黃色顆粒明顯減少，高劑量亦減少，與低、中劑量比稍高 (見圖2)。

3 討論

因昆明種小鼠和裸鼠的荷瘤率均為100%，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯烤浦评嵌究鼓[瘤的作用及對(duì)胸腺、脾臟等重要臟器的影響，所以荷瘤小鼠選的是昆明種小鼠而非裸鼠。

圖1 生藥狼毒和各組酒制狼毒及腫瘤對(duì)照組Bax的表達(dá) (DAB×400)Fig.1 Comparison of the expression of Bax among crude Stellera chamaejasme，groups of liquorsaturated Stellera chamaejasme and tumor contrast(DAB×400)

圖2 生藥狼毒和各組酒制狼毒及腫瘤對(duì)照組Bcl-2的表達(dá) (DAB×400)Fig.2 Comparsion of the expression of Bcl-2 among groups of crude Stellera chamaejasme，liquorsaturated Stellera chamaejasme and tumor contrast(DAB×400)

中藥狼毒在中國(guó)被廣泛應(yīng)用于治療腫瘤，其中有多種成分被發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤的功能［6］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)生藥狼毒的抗腫瘤作用明顯。在表1中可以看到生藥狼毒的最大抑瘤率達(dá)到69.45%。炮制后，低、中劑量酒制狼毒抑瘤率大幅提高，尤其低劑量酒制狼毒的抑瘤率高達(dá)98.40%，中劑量酒制狼毒也達(dá)到87.16%，比同劑量生藥狼毒的抑瘤率增加，這說(shuō)明用白酒炮制后能顯著提高生藥狼毒的療效。狼毒又名斷腸草［7］，對(duì)身體的危害較大，用白酒炮制后低劑量就能達(dá)到很好的抑瘤作用，這樣就可以減少狼毒的用量，從而能減輕狼毒對(duì)身體的傷害。至于高劑量酒制狼毒比生藥狼毒的抑瘤率降低，需進(jìn)一步做實(shí)驗(yàn)探討其機(jī)理。

經(jīng)白酒炮制后既提高了狼毒的療效亦能降低其對(duì)脾臟和胸腺的損害，從表2中可以看到，與正常對(duì)照組比較，酒制低、中、高劑量組的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)P＞0.05，說(shuō)明沒有差異，經(jīng)白酒炮制后狼毒的毒性明顯降低，對(duì)脾、胸腺?zèng)]有明顯損害。與正常對(duì)照組比較，生藥狼毒的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均P＜0.05，說(shuō)明有顯著性差異，生藥狼毒對(duì)脾和胸腺的損傷較大。從表2數(shù)據(jù)可以得出，與生藥狼毒組比較，酒制低、中、高劑量各組的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均P＜0.05，說(shuō)明經(jīng)白酒炮制后確實(shí)減輕了狼毒的毒性，明顯降低了對(duì)這些免疫臟器的損傷。經(jīng)白酒炮制后用較低劑量的狼毒就能達(dá)到很理想的抑瘤作用，對(duì)脾、胸腺等重要器官又沒有明顯的毒副作用，為狼毒用于臨床抗腫瘤提供新的思路。

酒制狼毒與生藥狼毒比較能顯著提高抑瘤率，其作用機(jī)制可能是使Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)逐漸下調(diào)。抗凋亡基因編碼的Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜、細(xì)胞膜內(nèi)表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜等處［8］。它廣泛存在于造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都表明Bcl-2基因可抑制各種刺激下多種細(xì)胞的凋亡［9］。Bcl-2抗凋亡的機(jī)制目前認(rèn)為主要有:①拮抗促凋亡基因bax;②抑制促凋亡的蛋白質(zhì)細(xì)胞色素c自線粒體釋放到胞質(zhì);③ 阻止胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c激活caspase;④有抗氧化及維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等作用［10］。Bax基因?qū)儆贐cl-2基因家族，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對(duì)Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用。研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，因此認(rèn)為，Bax是極重要的促細(xì)胞凋亡基因之一［11］。Bcl-2基因啟動(dòng)子具有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)并受其調(diào)控，故NF-κB可活化通過(guò)誘導(dǎo)Bcl-2及其他抗凋亡基因而阻止細(xì)胞凋亡。也可通過(guò)刺激IL-1β轉(zhuǎn)化蛋白酶、c-myc和TNF-α基因表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［12］。

本研究結(jié)果顯示，與腫瘤對(duì)照組比較，生藥狼毒組和各組酒制狼毒小鼠腫瘤細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡，這與前面生藥狼毒和各組酒制狼毒均有明顯的抑瘤作用一致;與生藥狼毒組比較，酒制狼毒低、中、高劑量各組小鼠腫瘤細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量高，Bcl-2蛋白有表達(dá)降低。表明酒制狼毒比生藥狼毒抑瘤作用提高可能是通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生藥狼毒經(jīng)白酒炮制后既大大提高了抑瘤作用，又顯著降低了對(duì)胸腺、脾臟的毒副作用，臨床可考慮用酒制狼毒代替生藥狼毒入藥，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)需進(jìn)一步研究。

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