何嘉侖， 唐洪梅*， 涂 星， 李得堂， 丘振文

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405)

吳茱萸Evodia rutaecarpa為蕓香科植物吳茱萸、石虎及疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)。吳茱萸堿(evodiamine)和吳茱萸次堿 (rutaeearpine)等吲哚喹啉類(lèi)生物堿是其有效活性成分，藥理學(xué)研究證明吳茱萸堿和吳茱萸次堿具有降壓、心臟保護(hù)、松弛非血管平滑肌、抗血栓、抗過(guò)敏、抗腫瘤、減肥、調(diào)節(jié)體溫、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，涉及心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，外用對(duì)治療咳嗽、口腔潰瘍、小兒皰疹性咽峽炎、高血壓等疾病具有良好的效果［1-3］。吳茱萸堿和吳茱萸次堿為難溶性化合物，幾乎不溶于水和多數(shù)有機(jī)溶劑，口 困難［4］。全身給予吳茱萸堿和吳茱萸次堿 揮該類(lèi)化合物鎮(zhèn)痛作用的理想給藥途徑。而 用藥物可直達(dá)病灶區(qū)，提高局部藥物濃度 藥物在全身循環(huán)或其它組織的分布，降低出 不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)［5］。因此局部施藥為首選 徑，局部施藥的關(guān)鍵是藥物的經(jīng)皮滲透能力，經(jīng)皮滲透能力可通過(guò)添加促滲劑來(lái)改善，促滲劑通過(guò)改變皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)或蛋白間的相互作用提高藥物的滲透量［6］。為更好研究吳茱萸提取物體外經(jīng)皮滲透行為，本研究建立體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)方法，考察不同促滲劑及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)吳茱萸貼劑體外經(jīng)皮吸收的影響，以篩選最佳質(zhì)的促滲劑及其最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

TK—12A型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，7 mL立式玻璃擴(kuò)散池，接口面積2.92 cm2(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司);KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗器 (江蘇省昆山市超聲儀器有限公司);Agilent HP1200型高效液相色譜儀;BP211D型電子分析天平;RE—2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠(chǎng))。

吳茱萸購(gòu)自嶺南中藥飲品有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》要求;氮酮 (Azone，AR級(jí)，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司);油酸 (AR級(jí)，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng));1，2-丙二醇 (汕頭市光華化學(xué)品廠(chǎng));

裸鼠，6～7周齡，體質(zhì)量 (80±15)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物衛(wèi)生許可證號(hào)為 SCXK(粵)2008-0020，粵監(jiān)證字2008A002。

2 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)方法

2.1 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的體外分析方法建立

2.1.1 供試藥液的配制

吳茱萸提取物的制備 精密稱(chēng)取吳茱萸300 g，加入5倍量95%乙醇提取超聲2次，每次40 min，合并所得提取液，在50℃條件下減壓濃縮至流浸膏，用95%乙醇定容至25 mL，置于棕色容量瓶中，得到吳茱萸提取物，于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆?(經(jīng)測(cè)定，每1 mL含吳茱萸堿250.086 7 μg，吳茱萸次堿62.213 3 μg)。

對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取吳茱萸堿約0.6 mg、吳茱萸次堿約0.2 mg，加30%乙醇至70%生理鹽水定容至每1 mL含吳茱萸堿60 μg、吳茱萸次堿20 μg的混合貯備液。

2.1.2 色譜條件［7］Phenomenex C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水 (49∶51);檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫25℃。在此條件下，測(cè)得吳茱萸堿峰的保留時(shí)間約為12.69 min(1號(hào)峰)，吳茱萸次堿峰的保留時(shí)間約為14.73 min(2號(hào)峰)。理論塔板數(shù)按蛇床子素計(jì)應(yīng)不小于3 000，最低檢測(cè)限吳茱萸堿為0.5 μg/mL，吳茱萸次堿為0.20 μg/mL，見(jiàn)圖1。

圖1 吳茱萸HPLC圖譜Fig.1 Evodia rutaecarpa extract HPLC chromatograms

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 取對(duì)照品貯備液加30%乙醇至70%生理鹽水溶液制成含吳茱萸堿質(zhì)量濃度為1.25、2.5、7.5、15、37.5、60 μg/mL 和吳茱萸次堿0.20、0.67、1.34、6.7、12.8、20.1 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，以吸收峰面積 (A)對(duì)質(zhì)量濃度 (C)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得吳茱萸堿回歸方程為A=36.341 3C－25.998 4，r=0.999 9;吳茱萸次堿回歸方程為A=50.829 8C+5.084 4，r=1.000 0。結(jié)果表明，吳茱萸堿、吳茱萸次堿分別在1.2～60 μg/mL、0.20～20.1 μg/mL范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取吳茱萸堿和吳茱萸次堿對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度分別為 7.5 μg/mL和 6.7 μg/mL)10 μL，分別在1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次，每次進(jìn)樣3針，以平均峰面積計(jì)算日內(nèi)精密度，RSD分別為1.47%、1.23%;在6 d內(nèi)每天測(cè)定1次，每次進(jìn)樣3針，以平均峰面積計(jì)算日間精密度，RSD分別為2.33%、2.90%。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.2 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)

2.2.1 裸鼠皮膚的處理［8］取6～8周齡的裸鼠，處死后小心剝離腹部皮膚，剔除皮下脂肪組織及黏連物;用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)前自然解凍，每次實(shí)驗(yàn)前檢查皮膚的完整性，不能有任何破損。

2.2.2 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)方法 將處理好的裸鼠腹部皮膚固定于擴(kuò)散池的供給池與接受池之間，角質(zhì)層面向供給池。供給池中加入1.5 mL吳茱萸提取物及相應(yīng)的促滲劑，接受池中加入7 mL 30%乙醇至70%生理鹽水溶液作為接收介質(zhì)，排出氣泡使液面恰與皮膚內(nèi)層接觸。調(diào)節(jié)擴(kuò)散儀至恒溫(32±1)℃，恒速攪拌 (約200 r/min)，分別于攪拌開(kāi)始后 0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h從樣品接受池中抽取1 mL接受液，同時(shí)補(bǔ)加同溫度同體積接收液。將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出的接受液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，供HPLC進(jìn)樣分析，并以此計(jì)算累積滲透量及滲透系數(shù)。

依法測(cè)定供試品液中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的量，并按下式計(jì)算累積滲透量 (Q)、滲透速率常數(shù) (J)和增滲倍數(shù) (ER)。

式中，Q為t時(shí)間藥物的面積透過(guò)量 (μg/cm);Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)的的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);Ci為第i個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);J為透皮速率常數(shù) ［μg/(cm·h)］;J0為未加促滲劑的透皮速率常數(shù) ［μg/(cm·h)］;W為24 h藥物的總透過(guò)率;M為供體池中藥物的量(μg)。

2.2.3 相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下不同促滲劑對(duì)吳茱萸提取物的經(jīng)皮吸收的影響 在供體池中分別加入3%的氮酮、油酸和1，2-丙二醇作為促滲劑，以不加任何促滲劑組為空白對(duì)照，按2.2.2項(xiàng)下試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1和圖2。

表1 相同濃度不同促滲劑對(duì)吳茱萸提取物經(jīng)皮吸收的影響結(jié)果(±s，n=5)Tab.1 Effect of different kinds of enhancers on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract(±s，n=5)

表1 相同濃度不同促滲劑對(duì)吳茱萸提取物經(jīng)皮吸收的影響結(jié)果(±s，n=5)Tab.1 Effect of different kinds of enhancers on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract(±s，n=5)

注:與空白組相比，＊＊P ＜0.01。

－2.964 5 0.985 9 0.386 9±0.11 0.93成分 促滲劑 Higuchi方程 R J/(μg·cm－2·h－1) ER空白 Q=1.233 2t－3.300 1 0.992 1 1.233 2±0.82 1吳茱萸堿 氮酮 Q=3.259 6t－14.831 4 0.979 3 3.259 6±0.52＊＊ 2.64油酸 Q=3.445 9t－5.967 3 0.987 2 3.445 9±0.67＊＊ 2.79丙二醇 Q=3.019 2t－1.694 3 0.997 2 3.019 2±0.26＊＊ 2.45空白 Q=0.414 2t－2.810 8 0.994 5 0.414 2±0.09 1吳茱萸次堿 氮酮 Q=0.531 4t－4.043 8 0.993 1 0.531 4±0.19 1.28油酸 Q=1.054 3t－1.439 2 0.950 3 1.054 3±0.12＊＊ 2.54丙二醇 Q=0.386 9t

圖2 3%用量的促滲劑對(duì)吳茱萸提取物經(jīng)皮吸收的影響Fig.2 Effect of different kinds of enhancers on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract

通過(guò)表和圖可以看出，3種促滲劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%對(duì)吳茱萸堿與吳茱萸次堿的促滲效果依次為油酸＞氮酮＞1，2-丙二醇，且油酸對(duì)吳茱萸堿與吳茱萸次堿的滲透速率均明顯高于空白組 (P＜0.01)?？蛇M(jìn)一步研究不同用量的油酸對(duì)吳茱萸提取物的經(jīng)皮吸收的影響。

2.2.4 不同用量的油酸對(duì)吳茱萸提取物的經(jīng)皮吸收的影響 在供體池中分別加入3%、5%、7%的油酸作為促滲劑，以不加任何促滲劑組為空白對(duì)照，按2.2.2項(xiàng)下試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2和圖3。

表2 不同用量油酸對(duì)吳茱萸提取物經(jīng)皮吸收結(jié)果(±s，n=5)Tab.2 Effect of different amounts of oleic acid on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract(±s，n=5)

表2 不同用量油酸對(duì)吳茱萸提取物經(jīng)皮吸收結(jié)果(±s，n=5)Tab.2 Effect of different amounts of oleic acid on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract(±s，n=5)

注:與空白組相比，＊＊P ＜0.01。

3%油酸 Q=3.445 9t－5.967 3 0.987 2 3.445 9±0.67＊＊ 2.79 5%油酸 Q=3.563 3t－0.900 5 0.994 2 3.563 3±0.71＊＊ 2.89 7%油酸 Q=3.634 9t－0.074 3 0.997 7 3.634 9±0.51＊＊ 2.94空白 Q=0.414 2t－2.810 8 0.994 5 0.414 2±0.09 1吳茱萸次堿成 分 用 量 Higuchi方程 r J/(μg·cm－2·h－1) ER空白 Q=1.233 2t－3.300 1 0.992 1 1.233 2±0.82 1吳茱萸堿3.00 3%油酸 Q=1.054 3t－1.439 2 0.950 3 1.054 3±0.12＊＊ 2.54 5%油酸 Q=1.155 7t－0.367 2 0.966 0 1.155 7±0.24＊＊ 2.79 7%油酸 Q=1.242 1t－0.725 5 0.998 7 1.242 1 ±0.29＊＊

圖3 不同用量油酸對(duì)吳茱萸提取物的經(jīng)皮吸收的影響Fig.3 Effect of different amounts of oleic acid on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract

結(jié)果表明，對(duì)于吳茱萸堿和吳茱萸次堿而言，3組不同用量的油酸對(duì)吳茱萸堿與吳茱萸次堿的滲透速率均明顯高于空白組 (P＜0.01)，且依次為7%油酸＞5%油酸＞3%油酸。

3 討論

吳茱萸堿與吳茱萸次堿的體外經(jīng)皮滲透具有滲透速率慢、時(shí)滯長(zhǎng)、累積滲透量少的特點(diǎn)［9］，而添加促滲劑是改善其經(jīng)皮滲透的重要方法，本實(shí)驗(yàn)選用了幾種常見(jiàn)的促滲劑種類(lèi)，對(duì)3種不同促滲劑及其不同用量油酸對(duì)吳茱萸提取物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的經(jīng)皮吸收行為進(jìn)行考察。

從相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，不同促滲劑對(duì)吳茱萸提取物的經(jīng)皮吸收的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，油酸的促滲作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他促滲劑。Naik等［10］證實(shí)油酸通過(guò)增加角質(zhì)層脂質(zhì)相分離和流動(dòng)性發(fā)揮促滲作用。油酸具有良好的脂溶性，能增加角質(zhì)層脂質(zhì)的流動(dòng)性，降低角質(zhì)層的屏障作用，并提高吳茱萸堿與吳茱萸次堿分配和滲透速率，縮短其時(shí)滯，增加吳茱萸堿與吳茱萸次堿的累積滲透量，實(shí)現(xiàn)快速起效。

從不同用量的油酸對(duì)吳茱萸提取物的經(jīng)皮吸收的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，油酸用量越高，對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿的促滲效果越好，最終篩選出以7%用量的油酸作為促滲劑時(shí)可以較好的促進(jìn)吳茱萸堿和吳茱萸次堿的經(jīng)皮吸收，該研究結(jié)果為吳茱萸外用制劑的制備和臨床用藥劑量提供合理的數(shù)據(jù)和參考。

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