張 良

蜂膠是經(jīng)驗豐富的工蜂采集生命力極強的白楊、白樺、榕樹等嫩芽和花蕾及樹脂類物質(zhì)，歸巢后幾番吐哺，與其舌腺分泌物混合而制成的膠粘物質(zhì)。蜂膠乙醇提取物(EPF)中含有豐富的黃酮類化合物、脂肪酸及酯類、氨基酸、維生素和多種活性酶類。研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠黃酮(EPF)對環(huán)磷酰胺(CTX)致肝正常細胞HL-7702損傷具有保護作用，為證實此觀點，筆者進行了動物實驗，旨在進一步研究并證實EPF對化療藥物損傷的保護作用，為進一步將其開發(fā)為新型高效的天然抗腫瘤藥物和細胞保護劑奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 EPF:由日本醫(yī)科大學生命科學中心采用乙醇提取，紫外光譜鑒定并定量檢測。人正常肝細胞(HL-7702)由日本醫(yī)科大學生命科學研究中心提供。WST-1凋亡檢測試劑盒、Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自Qiagen公司;氧化氫酶(CAT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)等活性及尿素氮(BUN)試劑盒、EB/溴化乙錠、吖啶橙購自羅氏公司。BALB/C野生型小鼠，6周齡(購自日本琦玉縣KUREA株式會社)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在含10%滅活新生牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。細胞生長曲線實驗:將對數(shù)生長期的HL7702細胞用0.25%胰酶消化，含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×104/mL，每孔100 μL，分別加入到4塊96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h細胞貼壁后，向各孔中分別加入 CTX 4 ng/L、EPF(20、30、40 ng/L，每個濃度設5個復孔)。分別培養(yǎng)24 h，PBS沖洗3次后，各孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL WST-1，繼續(xù)在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。酶標儀測定各孔OD值(光密度)，空白孔調(diào)零，選擇450 nm為測定波長、630 nm為參考波長，以藥物濃度為橫坐標、OD為縱坐標繪制細胞生長曲線。實驗重復3次，確定結(jié)果穩(wěn)定性。

1.2.2 蜂膠黃酮提取 稱取蜂膠1.0 g，乙醇加至100 mL，漩渦混合，超聲波發(fā)射器超聲20 min，500 r/min離心2 min，重復超聲處理20 min，反復上述步驟2次，70%乙醇溶解并紫外光譜分析儀鑒定，陽性對照為蘆丁。

1.2.3 吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染色實驗24孔板按5×104個細胞/孔密度接種細胞懸液，培養(yǎng)24 h后向各孔中分別加CTX(4 ng/L)、EPF(20、40、60 ng/L)，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，每孔分別加200 μL AO染液(100 mg/L)及 200 μL EB 染液(100 mg/L)，室溫放置5 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Annexin-V-FITC/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞處理方法同上，PBS清洗細胞2次，0.25%胰酶消化細胞，500 r/min離心5 min收集細胞。收集1×106單細胞懸液，加入Binding buffer 100 μL和 Annexin-V-FITC(20 μg/mL)10 μL，室溫避光30 min。加入 PI(50 μg/mL)5 μL，用 Binding buffer加至400 μL，用FACS進行流式細胞術定量檢測。

1.2.5 動物模型 健康鼠隨機均分為5組，雌雄各半。對照組灌胃生理鹽水;模型組單獨給予CTX;3個劑量試驗組每天分別灌服樣品100、200、400 mg/mL，0.5 mL/只，連續(xù)給藥 10 d，同時注射CTX 0.15 g/kg，共3 d。小鼠眼眶取血檢測外周血象，肝素抗凝，根據(jù)試劑盒操作過程分析檢測血清檢測中各項酶的指標。

1.2.6 統(tǒng)計分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，兩組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EPF對CTX誘導的HL7702生長抑制影響對人肝細胞系HL7702生長增殖的影響，如圖1所示，在單獨存在CTX(4 ng/L)時，HL-7702均處于生長抑制狀態(tài);加入EPF時，實驗組細胞生長抑制明顯改善，并隨著EPF多肽濃度的增加，當EPF濃度達到40 ng/L時，促進生長作用顯著增加，各組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果顯示，EPF對CTX誘導的HL7702生長抑制具有拮抗作用。

圖1 EPF對CTX處理HL-7702的保護作用

2.2 EPF對CTX誘導的HL7702細胞凋亡形態(tài)影響 見圖2。結(jié)果顯示，單獨應用CTX(4 ng/L)組，絕大部分細胞核被染成橙紅色，核皺縮或碎裂，為晚期凋亡或死亡細胞。EPF與CTX聯(lián)合應用，EPF肽強烈抑制CTX對HL7702的損傷作用。凋亡細胞明顯減少，絕大多數(shù)細胞形態(tài)飽滿，幾乎沒有死亡細胞。AO/EB染色實驗結(jié)果表明，從形態(tài)角度觀察，EPF對CTX誘導的HL7702細胞凋亡形態(tài)影響具有抑制作用。

圖2 EPF對CTX處理的HL7702AO/EB雙染結(jié)果

2.3 EPF對CTX誘導的HL7702細胞凋亡影響Annexin-V-FITC/PI染色，流式細胞術分析細胞凋亡實驗結(jié)果見圖3。CTX單獨處理的HL7702細胞組24 h晚期凋亡細胞占30.2%，CTX與EPF共處理細胞組凋亡細胞分別占19.2%、13.1%和7.1%，隨著EPF濃度增加，凋亡細胞逐漸減少，活細胞和早期凋亡細胞明顯增多。CTX單獨處理的HL7702細胞組24 h早期凋亡細胞占57.2%，CTX與EPF共處理細胞組凋亡細胞分別占29.7%、17.1%和9.5%，隨著EPF濃度增加，早期凋亡細胞逐漸減少，活細胞明顯增多。

2.4 EPF對小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影響 如圖4所示，模型組小鼠血清CAT、LDH、CK、GOT和GPT等酶活性以及血清BUN含量與對照組差異有統(tǒng)計學意義，然而此類CTX介導的毒性反應均在一定程度上被EPF緩解。

圖3 EPF對CTX處理的HL7702細胞凋亡率影響

圖4 EPF對小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影響

3 討論

惡性腫瘤的治療手段有多種，化療仍是目前極為重要的基本手段之一［1-2］，且存在靶向性差異。多數(shù)抗腫瘤藥物均可在殺死腫瘤細胞的同時，無選擇地破壞正常組織，造成廣泛與嚴重的急/慢性蓄積毒性，導致化療藥物的劑量限制而引起治療指數(shù)狹小的不良反應，限制了癌癥治療的最佳用藥［3］。同時，化療藥物作用可引起機體衰弱、消化障礙、骨髓抑制等不良反應也是終止腫瘤治療的主要原因，因此，在抗腫瘤治療時，能最大程度地殺傷腫瘤細胞且對正常組織破壞最小已經(jīng)成為化療藥物臨床應用的目標。其相關研究也是當今抗腫瘤藥物研究與開發(fā)領域的一大熱點［4］。

蜂膠是蜜蜂從植物的幼芽和枝條上采集的樹脂類物質(zhì)，蜂膠提取物無明顯肝腎功能損害。其在不同地區(qū)化學成分各異，生理活性亦不同。筆者采用乙醇純化方法提取的蜂膠主要成分為黃酮類。黃酮化合物有抗菌、抑制腫瘤細胞生長、降壓、預防紫外線損傷等作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)EPF具有較好的化療保護功能，并通過細胞實驗和動物實驗結(jié)果證實。為探求EPF對于CTX損傷HL7702細胞的保護作用，本研究采用WST-1細胞增殖試驗。WST-1是一種類似于MTT的化合物，是MTT的升級替代產(chǎn)品，WST-1和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。故實驗結(jié)果更加精確可信。

在本研究中，在HL7702細胞培養(yǎng)液中分別加入CTX和不同濃度的EPF(20～40 ng/L)，培養(yǎng)24 h，細胞的增殖抑制在EPF濃度達到20 ng/L后得到改善，EPF濃度到40 ng/L后具有明顯的保護作用，同樣 AO/EB雙染實驗和 Annexin-V-FITC/PI流式細胞實驗也支持這一實驗結(jié)果。

動物實驗結(jié)果進一步確定EPF對CTX化療損傷的保護作用，這可能與EPF具有抗氧作用有關。EPF可以清除體內(nèi)過多的自由基，減少自由基對機體正常細胞的損傷，維持體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，有效抑制CTX造成的機體自由基損傷［5-6］，表現(xiàn)為血清CAT下降，同時對CTX導致的肝損傷具有明顯的保護作用，表現(xiàn)為GOT與GPT下降。本研究顯示，CPF具有對CTX引起的化療損傷較明顯的保護作用，為進一步研究和應用提供理論依據(jù)。

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［1］Carini F，Saggese V，Porcaro G，et al.Surgical protocol in patients at risk for bisphosphonate osteonecrosis of the jaws:clinical use of serum telopetide CTX in preventive monitoring of surgical risk［J］.Ann Stomatol(Roma)，2012，3(1):31-36.

［2］Min Wu，Mark R，Kelley W，et al.Reduction of BCNU toxicity to lung cells by high-level expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280(4):755-761.

［3］Ragg S，Xu-Welliver M，Bailey J，et al.Direct reversal of DNA damage by mutant methyltransferase protein protects mice against dose-intensified chemotherapy and leads to in vivo selection of hematopoietic stem cells［J］.Cancer Res，2000，60(18):5187-5195.

［4］馬培奇.細胞保護劑氨磷汀及其臨床應用及展望［J］.中國腫瘤，2001，10(8):471.

［5］Arap W，Pasqulini R，Ruoslahti E.Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model［J］.Science，1998，279(5349):377-380.

［6］Stollman TH，Ruers TJ，Oyen WJ，et al.New targeted probes for radioimaging of angiogenesis［J］.Methods，2009，48(2):188-192.