熒光法海水葉綠素a 傳感器設(shè)計(jì)

張可可，閆星魁，陳世哲，劉世萱，齊勇

(山東省海洋環(huán)境監(jiān)測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院海洋儀器儀表研究所，山東 青島 266001)

工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展使海洋污染日趨嚴(yán)重，對海水中浮游植物現(xiàn)存量進(jìn)行實(shí)時(shí)、有效的監(jiān)測成為海水污染監(jiān)測和治理的關(guān)鍵［1］。葉綠素a 是海洋生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要參數(shù)，原位葉綠素a 分析已經(jīng)成為海洋生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測的重要手段之一［2］。傳統(tǒng)的葉綠素a 濃度測量大都是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，而現(xiàn)場、長期的自動觀測，對于海洋水質(zhì)監(jiān)測具有非常重要的意義?，F(xiàn)在的便攜式原位檢測儀器，基本都是從國外進(jìn)口，價(jià)格昂貴。設(shè)計(jì)實(shí)用的海水葉綠素原位監(jiān)測設(shè)備，對于我國進(jìn)行海洋水質(zhì)監(jiān)測、赤潮的提前預(yù)報(bào)等具有極其重要的意義。本文設(shè)計(jì)的熒光葉綠素a 傳感器基于熒光誘導(dǎo)檢測原理結(jié)合微弱信號檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對海水葉綠素a濃度的原位監(jiān)測。設(shè)備應(yīng)用微弱光電感應(yīng)、濾波和鎖相放大濾波等微弱信號檢測技術(shù)將信號從周圍的噪聲中提取出來，檢測探頭的機(jī)械結(jié)構(gòu)采用15°夾角的背光接收模式，具有小型化、易于操作的特點(diǎn)。

1 葉綠素a 檢測原理

熒光分析法作為應(yīng)用熒光技術(shù)的一種分析方法，已經(jīng)成為微量物質(zhì)分析中應(yīng)用最為廣泛的方法之一。熒光產(chǎn)生的過程實(shí)際上是分子受激發(fā)而產(chǎn)生的能量輻射過程，一個(gè)分子中處于基態(tài)能級的電子吸收了滿足一定頻率條件的光子后，躍遷到更高的能級而處于激發(fā)態(tài)，由于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，在極短的時(shí)間內(nèi)，它們首先因分子間相互碰撞而以熱的形式損失掉一部分能量，從所處激發(fā)態(tài)下降至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，然后再由這一能級下降至基態(tài)的任何振動能級。在后一過程中，激發(fā)態(tài)分子以光的形式釋放出所吸收的能量，發(fā)出的光稱為熒光［3-4］。

利用激發(fā)光誘導(dǎo)熒光對自然水體的水質(zhì)監(jiān)測是一種快速、實(shí)時(shí)和在線的檢測方法［5］，波長在460 nm 附近的藍(lán)光和685 nm 附近的紅光均可誘導(dǎo)出熒光，由于685 nm 附近的紅光誘導(dǎo)出的熒光波長與激發(fā)紅光波長相近［6-7］，為了能夠有效的區(qū)分出熒光和激發(fā)光，本文采用460 nm 的藍(lán)光作為激發(fā)光源。

根據(jù)比爾-朗伯定律，當(dāng)葉綠素a 經(jīng)波長為460 nm 附近的光激發(fā)后，會誘導(dǎo)出680 nm 附近的熒光［8］，所發(fā)射的熒光強(qiáng)度為:

式中k 為儀器常數(shù);Q 為物質(zhì)熒光效率;I0為激勵(lì)光光強(qiáng);ε 為摩爾吸收系數(shù);b 為樣品光程差;c 為葉綠素a 的濃度。

展開(1)式中的指數(shù)項(xiàng)，可得:

海水中葉綠素a 的濃度較低，2.3εbc ?1，(2)式可簡化為:

根據(jù)式(3)可知，激發(fā)的熒光強(qiáng)度與葉綠素a 的濃度成正比，檢測接收到的熒光光強(qiáng)，經(jīng)過后續(xù)數(shù)據(jù)處理可以得到樣品中葉綠素a 的濃度。

熒光強(qiáng)度是由多個(gè)因素共同確定的，除了與葉綠素a 的濃度、吸光系數(shù)、熒光效率等參數(shù)有關(guān)外，還與激勵(lì)光光強(qiáng)、樣品光程差、光電轉(zhuǎn)換系數(shù)、電路放大倍數(shù)等因素有關(guān)。因此，設(shè)備檢測到的熒光強(qiáng)度是一個(gè)相對強(qiáng)度，需要在固定的光學(xué)環(huán)境下，采用標(biāo)準(zhǔn)濃度的葉綠素萃取液進(jìn)行標(biāo)定實(shí)驗(yàn)，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到的工作曲線，通過測量海水樣品所激發(fā)的熒光值，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理得到海水中的葉綠素a 的濃度。

2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

在葉綠素a 濃度較低的情況下，激發(fā)出的熒光非常微弱，經(jīng)過光電轉(zhuǎn)化后，其大小在nA 量級，這種量級的信號通常淹沒在周圍的噪聲中，設(shè)備采用微弱光電感應(yīng)技術(shù)、濾波技術(shù)和鎖相放大濾波技術(shù)等微弱信號檢測技術(shù)將信號從周圍的噪聲中提取出來，葉綠素a測量系統(tǒng)框圖如圖1 所示。

圖1 葉綠素a 測量系統(tǒng)框圖Fig.1 System block diagram of a chlorophyll-a measurement system

在光學(xué)設(shè)計(jì)上，關(guān)鍵技術(shù)首先在于濾光片的處理，用來消除雜散光產(chǎn)生的干擾信號。在低濃度的微光測量中，為提高測量靈敏度，要求濾光片截止很深，以避免極微弱的光泄露［9］。葉綠素a 激發(fā)光采用460 nm 藍(lán)光LED，濾光片采用北京大恒光電的窄帶干涉濾光片，在發(fā)射端采用中心波長為470 nm 的窄帶濾光片，半寬為30 nm，截止深度為OD6;接收端采用650 nm的高通濾光片，截止深度為OD6。檢測探頭的機(jī)械結(jié)構(gòu)模仿亞力克結(jié)構(gòu)，采用15°夾角的背光接收模式，方便以后加裝清潔用的刷子。

發(fā)射模塊電路通過TLC555 方波發(fā)生電路產(chǎn)生頻率為2f 的方波信號，經(jīng)過信號調(diào)理電路后，輸出占空比嚴(yán)格為50%的頻率為f 的方波，再將此信號分為兩路，一路用來驅(qū)動中心波長為460 nm 的藍(lán)光LED，另一路經(jīng)過延時(shí)電路送入鎖相放大電路作為同步信號。

接收模塊通過高通濾光片和光電感應(yīng)電路完成光電轉(zhuǎn)換，光電感應(yīng)電路采用Silicon Sensors 光電二極管PC10-2-TO5 實(shí)現(xiàn)。信號處理模塊將光電轉(zhuǎn)換得到的光信號經(jīng)前置的隔直、放大電路，輸出微弱的電信號，再經(jīng)過次級濾波、放大電路進(jìn)行信號放大，設(shè)計(jì)中使用高精度低噪聲放大器AD8641 作為前置放大和次級濾波主器件，然后利用AD8642 和OPA2277 完成信號放大-帶通濾波-放大電路，得到初步處理過的信號。鎖相濾波電路以輸入同步信號為基準(zhǔn)，將上級的輸入正弦波信號進(jìn)行鎖相濾波處理后輸出直流電平，得到平穩(wěn)的直流信號。采用C8051F021 單片機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，經(jīng)過AD 轉(zhuǎn)換將采樣的數(shù)據(jù)送至外部SRAM 存儲，并配合數(shù)字濾波技術(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，去除由于系統(tǒng)不穩(wěn)定等因素可能會出現(xiàn)的異常數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)處理得到海水葉綠素a 的濃度。

3 結(jié)果分析

葉綠素a 定標(biāo)采用實(shí)驗(yàn)室方法配置葉綠素a 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并使用蒸餾水稀釋配置濃度分別為0.1、1、10、20、30、40、50 μg/L 的7 種濃度的標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a 樣品稀釋溶液，用檢測設(shè)備樣機(jī)對各個(gè)濃度的樣品進(jìn)行檢測，得出系統(tǒng)測量值與標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a 濃度的對應(yīng)關(guān)系。表1 給出了采樣不同濃度葉綠素a 得到的5 組原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 不同濃度葉綠素a 原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 1 Original experimental data of different concentrations of chlorophyll-a

為了減小系統(tǒng)隨機(jī)噪聲引入的誤差，對多次采樣得到的檢測輸出信號進(jìn)行累加平均。根據(jù)表1 中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用最小二乘法對實(shí)際測量葉綠素a 濃度得到的輸出信號與標(biāo)準(zhǔn)濃度值進(jìn)行線性擬合，其擬合方程為:

式中:y 為檢測輸出信號幅值;x 為葉綠素a 標(biāo)準(zhǔn)濃度值。圖2 為標(biāo)準(zhǔn)濃度的葉綠素a 溶液與輸出信號的對應(yīng)關(guān)系，其線性擬合系數(shù)為0.999，可見在該測量濃度范圍內(nèi)，葉綠素a 濃度與檢測信號幅值呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系。

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，葉綠素a 在低濃度時(shí)，受環(huán)境影響較大，需要固定的光學(xué)環(huán)境進(jìn)行測量和定標(biāo)。同時(shí)，為了得到更高的檢測靈敏度和檢測精度，檢測設(shè)備需進(jìn)一步抑制電磁干擾噪聲，并優(yōu)化檢測設(shè)備的機(jī)械結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

本文在研究熒光法葉綠素a 檢測原理的基礎(chǔ)上，應(yīng)用熒光誘導(dǎo)技術(shù)和微弱信號檢測技術(shù)設(shè)計(jì)了熒光葉綠素α傳感器，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，系統(tǒng)設(shè)計(jì)具有可行性，可解決海水葉綠素a 濃度的高精度、長期連續(xù)自動監(jiān)測關(guān)鍵技術(shù)難題。檢測過程不需人工采樣和預(yù)處理，具有檢測靈敏度高、體積小、易于操作的特點(diǎn)，能夠廣泛應(yīng)用于海洋浮標(biāo)、潛標(biāo)、臺站、監(jiān)測船等不同監(jiān)測平臺，對我國海洋水質(zhì)監(jiān)測、赤潮的提前預(yù)報(bào)等具有極其重要的意義。

圖2 葉綠素a 濃度與輸出信號實(shí)驗(yàn)曲線Fig.2 Experimental curve of the output signals and the concentrations of chlorophyll-a

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