吳秋月， 陳 鵬， 仲月明， 周長(zhǎng)遠(yuǎn)， 沈丹紅， 蔣 菲

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009)

銀杏聚戊烯醇是銀杏Ginkgo bilobaL.葉中重要藥用和保健有效成分，是人體合成具廣泛重要生理作用的多萜醇及其衍生物的中間體，經(jīng)代謝形成多萜醇后可補(bǔ)充體內(nèi)多萜醇的不足，不僅可提高免疫功能、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促進(jìn)肝細(xì)胞再生［1-2］，而且還可改善膜的流動(dòng)性、穩(wěn)定性和滲透性，從而增強(qiáng)膜的融合［3-4］。這些藥用價(jià)值使銀杏聚戊烯醇更加凸顯成為具重要開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的生物活性成分。

目前銀杏雌株主要用于結(jié)實(shí)生產(chǎn)種核，銀杏雄株由于其生殖特性成為主要的葉用資源［5］。銀杏葉聚戊烯醇相對(duì)黃酮類(lèi)和萜內(nèi)酯類(lèi)化合物的量較高［6］，但由于其提取工藝復(fù)雜、成本高等，使其開(kāi)發(fā)利用進(jìn)展不及黃酮類(lèi)和萜內(nèi)酯類(lèi)化合物。銀杏聚戊烯醇是由一系列異戊烯基單元和終端異戊烯醇單元組成的一類(lèi)線形類(lèi)脂化合物［7］，極性很弱，因此可使用非極性或弱極性溶劑來(lái)提取。而提取中溶劑類(lèi)型、料液比、提取時(shí)間等顯著影響聚戊烯醇得率。各個(gè)重要影響因子的不同水平處理的提取體系已見(jiàn)有采取正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化選擇的報(bào)道［8］。為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用銀杏雄株資源，本研究采用響應(yīng)面 (Response Surface Methodology，RSM)法優(yōu)化超聲提取銀杏雄株葉片聚戊烯醇，以期為銀杏葉片聚戊烯醇的提取利用提供理論依據(jù)與應(yīng)用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 葉片采集與處理

取自揚(yáng)州大學(xué)銀杏園內(nèi)25株13年生雄株，栽培管理一致，生長(zhǎng)發(fā)育良好。分別于2011年6月～10月平均采集供試雄株樹(shù)冠內(nèi)、中、外以及雄株上、中、下的葉片，每株采集200片葉。銀杏葉片采摘后洗凈、瀝干，放入烘箱內(nèi)105℃殺青30 min，80℃烘至水分在10%以下，粉碎過(guò)80目篩，置于塑料袋內(nèi)密封后于-40℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器:KQ—500B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (RE—5299)，上海亞榮生化儀器有限公司;Shimadzu LC-10A高效液相色譜儀，日本島津公司;紫外檢測(cè)器 (SPD—10A)，日本島津公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG—9240A型)，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī) (GL—21M)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司。

實(shí)驗(yàn)試劑:聚戊烯醇C85對(duì)照品、C90對(duì)照品、C95對(duì)照品，購(gòu)自瑞典Larodan公司。石油醚、正己烷、乙酸乙酯等試劑均為分析純，200～300目硅膠，HPLC用甲醇、異丙醇、正己烷為色譜純，HPLC用水為超純水，其他用水為雙蒸水。

1.3 銀杏葉聚戊烯醇的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取銀杏雄株葉粉末3 g，加入提取溶液用超聲波法提取，提取一段時(shí)間后過(guò)濾，然后進(jìn)行皂化反應(yīng) (5%氫氧化鈉甲醇溶液，料液比1∶3，超聲2.5 h，溫度45℃)，取上層黃色澄清液體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，硅膠柱層析 ［5 g硅膠干法裝柱，石油醚-乙酸乙酯 (9∶1)洗脫，收集20 mL］，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，溶解于2 mL的正己烷中，得聚戊烯醇的提取物以供HPLC檢測(cè)。

1.4 HPLC檢測(cè)

1.4.1 高效液相色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠柱色譜柱 (150 mm×6.0 mm，5 μm);柱溫為30℃;流動(dòng)相為異丙醇 -甲醇 -正己烷 -水(50∶25∶10∶2);體積流量為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm;進(jìn)樣量為10 μL。HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

1.4.2 聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 王成章曾采用四種聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試樣品，發(fā)現(xiàn)不同鏈長(zhǎng)的聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)樣品測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差小于3%，因此，在HPLC定量分析時(shí)，可以認(rèn)為不同鏈長(zhǎng)的聚戊烯醇對(duì)應(yīng)的各色譜峰具有相同的響應(yīng)因子［17］，所以本實(shí)驗(yàn)選擇其中一種聚戊烯醇C90-Prenol作為外標(biāo)物，以建立聚戊烯醇的HPLC的定量方法，從而對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。

圖1 不同聚戊烯醇對(duì)照品和供試樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and the samples

取對(duì)照品C90-Prenol 0.02 g，精密稱(chēng)定，用正己烷溶解，置于100 mL量瓶中，定容至刻度，得C90-Prenol標(biāo)準(zhǔn)貯備液 (0.20 mg/mL)。用移液管分別取C90-Prenol標(biāo)準(zhǔn)貯備液 5、10、20、40 mL，用正己烷定容至 50 mL量瓶，得 0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取各標(biāo)準(zhǔn)溶液和貯備液進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到聚戊烯醇線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為:Y=5×10-7X-2.950 6，R2=0.998 7。

式中:s1、s2、s3分別為 HPLC中 C85、C90、C95聚戊烯醇的峰面積;

A為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率;B為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的截距;n為稀釋倍數(shù);v為樣品體積;m為銀杏雄株葉片質(zhì)量。

1.5 銀杏雄株葉片聚戊烯醇超聲提取的主要影響因子及其處理水平的確定

影響銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取的因子有很多，綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料比較得出，銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取的主要影響因子有提取溶劑的類(lèi)型、超聲提取的料液比、溫度和時(shí)間，因此先設(shè)計(jì)確定提取溶劑類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)以料液比、時(shí)間、溫度為因子的單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響。

1.5.1 提取溶劑的確定 精密稱(chēng)取預(yù)處理好的銀杏雄株葉片粉末3 g共9份，分為3組，每組3個(gè)平行樣，分別用正己烷、石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行超聲提取，料液比1∶10 g/mL，超聲時(shí)間30 min，溫度40℃。比較得率，以確定最佳提取溶劑。

1.5.2 料液比對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響在本實(shí)驗(yàn)中，料液比是銀杏雄株葉片質(zhì)量與提取所用的溶劑的體積的比值。精密稱(chēng)取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，在40℃條件下，分別采用1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18的料液比，重復(fù)3次，超聲30 min以比較不同料液比對(duì)提取銀杏葉聚戊烯醇的影響。

1.5.3 超聲波時(shí)間對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響 精密稱(chēng)取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，在料液比1∶10，溫度40℃的條件下分別用15、30、45、60、75 min超聲波時(shí)間進(jìn)行超聲波浸提聚戊烯醇，重復(fù)3次，考察不同超聲波時(shí)間對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響。

1.5.4 溫度對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響精密稱(chēng)取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，在料液比1∶10，超聲時(shí)間為30 min的條件下下分別用20、30、40、50、60℃的超聲溫度進(jìn)行超聲波浸提聚戊烯醇，重復(fù)3次，考察不同超聲提取溫度對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響。

1.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［9-10］。選取影響銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的三個(gè)主要因素料液比、時(shí)間、超聲溫度進(jìn)行優(yōu)化組合。試驗(yàn)因素水平安排見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Tab.1 Experimental levels of factors in Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏雄株葉片聚戊烯醇超聲提取的主要影響因子及其處理水平的確定

2.1.1 提取溶劑的確定 提取溶劑的種類(lèi)是影響聚戊烯醇提取的重要因素之一，按照1.5.1項(xiàng)的方法考察了石油醚、正己烷和乙酸乙酯3種不同的溶劑對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理后結(jié)果如表2所示:石油醚、正己烷、乙酸乙酯均可用于聚戊烯醇的提取，其中正己烷的提取率顯著高于石油醚和乙酸乙酯，而石油醚和乙酸乙酯之間沒(méi)有顯著差異，因此綜合考慮得率及各種溶液的成本，本實(shí)驗(yàn)以正己烷作為提取溶劑。

表2 不同溶劑對(duì)聚戊烯醇得率的影響 (n=3)Tab.2 Effect of different solvents on yield of polyprenols(n=3)

2.1.2 料液比對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取率的影響 按照1.5.2項(xiàng)的方法考察不同料液比對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響，重復(fù)3次 (n=3)，不同處理下聚戊烯醇的得率見(jiàn)圖2。由圖可知，隨著料液比的增大，銀杏葉聚戊烯醇的得率逐漸增大，當(dāng)料液比超過(guò)1∶14 g/mL時(shí)，聚戊烯醇得率不再上升，反而有所下降。這說(shuō)明料液比對(duì)聚戊烯醇的提取影響較顯著，并非簡(jiǎn)單的正相關(guān)關(guān)系，因此，超聲波提取銀杏葉聚戊烯醇的料液比初步確定為1∶14 g/mL。

2.1.3 超聲波時(shí)間對(duì)銀杏雄株葉片提取率的影響按照1.5.3項(xiàng)的方法考察不同超聲波時(shí)間對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響，重復(fù)3次 (n=3)，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，銀杏雄株葉片聚戊烯醇的得率隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升再下降的總體趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為45 min時(shí)，得率達(dá)到最大。這說(shuō)明，提取時(shí)間對(duì)聚戊烯醇的得率有比較顯著的影響，時(shí)間過(guò)短，提取不充分，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能引起很多其他雜質(zhì)也逐漸溶出，導(dǎo)致得率降低。因此，超聲時(shí)間初步確定為45 min。

圖2 料液比對(duì)聚戊烯醇得率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on yield of polyprenols

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)聚戊烯醇得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time onyield of polyprenols

2.1.4 溫度對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響按照1.5.3項(xiàng)的方法考察不同超聲提取溫度對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響，重復(fù)3次 (n=3)，結(jié)果如圖4所示。由圖可知，隨著溫度的上升，聚戊烯醇得率逐漸增大，在40℃時(shí)，聚戊烯醇得率達(dá)到最大，超過(guò)40℃聚戊烯醇得率就逐漸下降，這可能是由于溫度越高，越有利于聚戊烯醇溶出，但是溫度過(guò)高可能就會(huì)破壞聚戊烯醇的結(jié)構(gòu)。因此，超聲提取中控制溫度初步確定為40℃。

2.2 銀杏雄株葉片聚戊烯醇響應(yīng)面法提取優(yōu)化設(shè)計(jì)

以料液比、超聲時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素為自變量，以聚戊烯醇得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的實(shí)驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

圖4 超聲提取溫度對(duì)聚戊烯醇提取率的影響 (n=3)Fig.4 Effect of ultrasonic extraction temperature on yield of polyprenols(n=3)

2.2.1 回歸分析建模 采用Design-Expert程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，3個(gè)因子經(jīng)過(guò)擬合得到的回歸方程為:Y=1.28-0.088X1+0.29X2-0.15X3-0.37X1X2+0.12X1X3+0.056X2X3-0.31X12+0.011X22-0.4X32模型的R2=0.916 9，這說(shuō)明這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的，使用該方程模擬真實(shí)的3因子3水平的分析是可行的［11-13］。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.3 Box-Behnken experiment design

2.2.2 方差分析 對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4:模型的F值8.58表示模型是顯著的，在這個(gè)模型中，X2、X3、X1X2、X12、X32對(duì)Y的影響是顯著的 (P＜0.05)，因此，各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)面和等值線分析 為了考察各個(gè)因子間的交互作用，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了3D響應(yīng)面和等值線分析。發(fā)現(xiàn)料液比和超聲溫度的交互作用最大，對(duì)聚戊烯醇得率的影響極為顯著;超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用次之;超聲時(shí)間和料液比的交互作用較小。其中反應(yīng)料液比和超聲溫度交互作用的響應(yīng)面見(jiàn)圖5。

表4 二次回歸模型方差分析Tab.4 Analysis of variance of quadratic regression model

用design-expert軟件進(jìn)行提取方案優(yōu)化，得到最佳條件為:料液比1∶11.28、超聲時(shí)間60 min、回流萃取溫度37.28℃，理論最佳得率為1.772%。

圖5 響應(yīng)面和等值線分析Fig.5 Analyses of Response surface and contour

2.3 最優(yōu)工藝參數(shù)組合驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RSM的可靠性，綜合單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮到實(shí)驗(yàn)誤差，按上述最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作，以液料比1∶12，超聲溫度38℃、超聲時(shí)間60 min的條件，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，試驗(yàn)結(jié)果，3組聚戊烯醇得率分別為1.653%，1.627%，1.481%，求得平均值為1.587%，與理論預(yù)測(cè)值比較誤差為0.185%，因此，響應(yīng)面法對(duì)銀杏葉聚戊烯醇提取條件的優(yōu)化是可行的，是具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值［14，15］。

3 討論

3.1 影響銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取的因子

影響銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取的因子有葉片處理過(guò)程中的葉片粉碎的顆粒大小，有提取過(guò)程中的超聲波功率，時(shí)間，溫度，有提取溶液的種類(lèi)，純度等，本研究首先對(duì)提取溶劑種類(lèi)進(jìn)行選擇，然后根據(jù)前人的研究經(jīng)驗(yàn)［8］，選擇了料液比、時(shí)間和溫度三個(gè)主要影響的因子，并設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，得到了在提取銀杏葉聚戊烯醇過(guò)程中這三個(gè)影響因子的最佳組合。而對(duì)于其他影響因子如粉碎顆粒大小、超聲波功率等還有待進(jìn)一步研究。

3.2 銀杏雄株葉片聚戊烯醇最佳提取工藝的關(guān)鍵技術(shù)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)法可以從整體的角度上確定各個(gè)影響因素的最佳組合，以達(dá)到最優(yōu)的響應(yīng)值。該方法已廣泛應(yīng)用于各種生物技術(shù)領(lǐng)域［11，13］。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)提取過(guò)程中的各因素進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳提取條件:以正己烷作為提取劑，料液比1∶12、超聲時(shí)間60 min、回流萃取溫度38℃，在此工藝條件下，銀杏聚戊烯醇的得率為1.587%。

3.3 銀杏葉不同鏈長(zhǎng)聚戊烯醇的相對(duì)含有量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

以往的研究結(jié)果表明，銀杏葉中含有C60-C120聚戊烯醇，其中主要為 C85、C90、C95聚戊烯醇，約占82%［16］。而C85和C90就可以占到銀杏葉聚戊烯醇總量的60%左右，老樹(shù)葉甚至可以達(dá)到70%［17］。Bamba等也曾以其中一種聚戊烯醇為內(nèi)標(biāo)物，定量分析銀杏葉中C85、C90、C95這3種聚戊烯醇［18-19］，因此本實(shí)驗(yàn)以C90作為外標(biāo)物，定量分析C85、C90、C95這3種聚戊烯醇的量作為銀杏雄株葉片聚戊烯醇含量的指標(biāo)。

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