鞠亞菲 隋牮箐 宋明全 姜相君#

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院1(266000) 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科2

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見消化道腫瘤，近年其發(fā)病率呈逐漸下降的趨勢(shì)，但仍是目前第4常見的惡性腫瘤，且死亡率位居所有惡性腫瘤的第二位［1］。我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)［2］，發(fā)病年齡以中老年居多［3］。目前胃癌的病因尚未完全闡明，涉及多種因素及其相互的作用。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是人類基因組DNA序列可遺傳變異的主要形式之一，可決定人類疾病的易感性，目前已被廣泛用于疾病病因探索、治療研究、預(yù)后評(píng)估等反映個(gè)體間易感性差異的研究。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(Runt-related transcription factor 3，RUNX3)是近年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，其基因多態(tài)性與亞洲人群胃癌的發(fā)生可能相關(guān)。本研究通過(guò)采用DNA直接測(cè)序法檢測(cè)RUNX3基因rs2236852位點(diǎn)的基因型，旨在探討該位點(diǎn)多態(tài)性與中國(guó)漢族人群胃癌發(fā)病的關(guān)系，以期初步了解rs2236852多態(tài)性與我國(guó)胃癌發(fā)病的關(guān)系。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選取2011年3月～2013年4月青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院確診的310例胃癌住院患者，并排除有胃部疾病以及腫瘤家族史者。同時(shí)從青島市市立醫(yī)院體檢中心選取同期327名健康體檢者作為對(duì)照組。標(biāo)本采集均獲得研究對(duì)象的知情同意，本研究方案經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

二、研究方法

1.基因組DNA提取:取EDTA抗凝靜脈血2 mL，采用血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)［天根生化科技(北京)有限公司］提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，－20℃冰箱保存。

2.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法:以RUNX3基因組序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)該基因rs2236852位點(diǎn)PCR引物，由Invitrogen公司提供。引物上游序列:5’-GAG GTG GCA GCC CTG CCA TA-3’，下游:5’-TGG AGT GGC TCC CCT CTT TCT G-3’，片段大小120 bp。PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，含 100 μg/L DNA 模板，10 × PCR 緩沖液 2.5 μL，50 mmol/L MgCl20.8 μL，10 mmol/L dNTP 混合液0.5 μL，5 μmol/L 正反向引物各 1 μL，Platinum?Taq DNA 聚合酶(Invitrogen公司)0.2 μL，加入滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。上ABI9700 PCR儀(美國(guó) ABI公司)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán);72℃終延伸5 min。取PCR產(chǎn)物2 μL行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.DNA直接測(cè)序分析基因型:確定目的片段擴(kuò)增成功后，加入POP-6膠，應(yīng)用ABI PRISMTM3700 DNA Analyzer進(jìn)行測(cè)序。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)以百分率表示?；蛐皖l率先行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，rs2236852位點(diǎn)基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的分析采用Logistic回歸分析，計(jì)算OR值及其95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

在研究期間納入的310例胃癌患者中，男206例，女104例，平均年齡(55.7±14.2)歲。327名對(duì)照者中，男219名，女108名，平均年齡(56.4±14.6)歲。兩組間性別構(gòu)成(P=0.889)、年齡(P=0.891)、吸煙狀況(P=0.055)和飲酒狀況(P=0.627)相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明樣本具有可比性。

二、rs2236852位點(diǎn)基因型

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明RUNX3基因rs2236852位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致，擴(kuò)增成功。

對(duì)照組測(cè)序結(jié)果表明RUNX3 rs2236852基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，表明樣本具有群體代表性。該位點(diǎn)AA、GA、GG基因型測(cè)序結(jié)果見圖1。

三、RUNX3 rs2236852基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

胃癌組與對(duì)照組的RUNX3 rs2236852基因型分布頻率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與AA基因型相比，GG基因型能顯著增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.46，95%CI:1.60～3.78)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AG基因型雖能提高胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.58，95%CI:0.99 ～2.54)(見表 1)。

圖1 RUNX3 rs2236852位點(diǎn)各基因型測(cè)序圖

表1 RUNX3基因rs2236852位點(diǎn)基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

討 論

RUNX3位于染色體1p36.1，長(zhǎng)約67 kb，含有 P1、P2兩個(gè)啟動(dòng)子以及6個(gè)外顯子，編碼由415個(gè)氨基酸殘基組成的核心結(jié)合因子(core binding factors，CBFs)。RUNX3蛋白是由α、β兩個(gè)亞單位構(gòu)成的異二聚體，α亞單位含有一段由128個(gè)氨基酸組成的高度保守域Runt結(jié)構(gòu)域(runt domain，RD)，能特異性識(shí)別目的基因并與之結(jié)合［4］。RUNX3作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中非常重要的調(diào)節(jié)因子，可與TGF途徑成員共同調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和凋亡［5］。RUNX3基因遺傳變異與腫瘤的研究目前較少見。Zhang等［6］的研究發(fā)現(xiàn)RUNX3基因rs2236852位點(diǎn)GG基因型能顯著增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

RUNX3基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生關(guān)系的研究結(jié)論目前未取得統(tǒng)一。Hishida等［7］報(bào)道了 RUNX3基因外顯子 1 rs6672420位點(diǎn)和內(nèi)含子rs760805位點(diǎn)T/A多態(tài)性與日本胃癌患者的關(guān)系，結(jié)果顯示幽門螺桿菌感染者中，與TT基因型相比，rs760805位點(diǎn)攜帶A等位基因(TA、AA、TA+AA基因型)可明顯促進(jìn)胃萎縮的發(fā)生(調(diào)整OR值分別為1.51、1.59和1.53)，但兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性均與胃癌無(wú)明顯關(guān)系。胡勝等［8］的研究發(fā)現(xiàn)RUNX3基因C364T突變與胃癌發(fā)生無(wú)關(guān)。Keller等［9］的研究分析了RUNX3基因多態(tài)性與34例德國(guó)家族性胃癌患者(20例彌散型，9例腸化生型和5例混合型)遺傳傾向的關(guān)系，但未發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)。Wu等［10］對(duì)RUNX3 10個(gè)標(biāo)簽SNPs與我國(guó)胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)標(biāo)簽SNPs的攜帶與胃癌風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)，分別為SNP3 rs11249206 CC基因型(與TT基因型相比，調(diào)整OR=1.75，95%CI:1.03 ～ 2.99)、SNP7 rs760805 AA 基因型(與 TT 基因型相比，調(diào)整 OR=1.82，95%CI:1.14 ～2.92)、SPN8 rs2236852 GG基因型(與AA基因型相比，調(diào)整OR=1.69，95%CI:1.05 ～ 2.72)。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組 RUNX3 rs2236852基因型分布頻率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與AA基因型相比，GG基因型能顯著增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.46，95%CI:1.60 ～3.78);AG 基因型可增加胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.58，95%CI:0.99 ～2.54)。

綜上所述，本研究結(jié)果初步顯示RUNX3基因rs2236852位點(diǎn)GG基因型可能與中國(guó)漢族人群的胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，但該結(jié)論尚需今后行更大樣本、設(shè)計(jì)更嚴(yán)格的多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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