張奇龍 徐 紅 王 麗 肖 竦

（貴陽醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室,貴州貴陽550004）

光石韋為水龍骨科蕨類植物光石韋Pyrrosia calvata(Bak.)Ching的全草，別名大肺癆草。具有清熱、利尿、止咳、止血的功效，主治：肺熱咳嗽、痰中帶血、小便不利、熱淋、沙淋、頸淋巴結(jié)核、燒燙傷、外傷出血[1,2]。石韋屬植物含有黃酮類化合物[3]。研究表明，黃酮類化合物具有抗過敏、降血壓、抗炎、抗菌、抗突變、抗?jié)?、抗病毒、保肝和降血脂等活性[4]。鑒于黃酮類化合物具有多種生理活性，對黃酮的研究具有重要的意義。不同種的石韋中總黃酮及其它有效成份的含量可能存在差異，這會導(dǎo)致不同種石韋在藥用功效上的不同，通過對這些物質(zhì)的測定，可對藥材的品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)[5]。已有文獻(xiàn)報(bào)道對石韋、氈毛石韋、華北石韋、有柄石韋、廬山石韋中的總黃酮進(jìn)行提取和含量測定[6,7]。但是，對光石韋中總黃酮含量的提取和測定未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們對光石韋中總黃酮的提取工藝及含量測定進(jìn)行研究，為光石韋的有效利用提供參考。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探究光石韋總黃酮的提取工藝，以蘆丁為對照品，用紫外分光光度法測定總黃酮含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器:UV-2401型分光光度計(jì) (日本島津)，BS210S型萬分之一電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)，DF-101S數(shù)控集熱式磁力攪拌器 (杰瑞爾電器有限公司)，HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 材料:光石韋 (Pyrrosia calvata(Bak.)Ching)藥材采自貴州省安順市紫云縣候場鎮(zhèn)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院趙俊華教授鑒定為光石韋。無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚(試劑為分析純)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總黃酮的測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁標(biāo)品 (干燥)20 mg，置于70%微熱乙醇中超聲溶解，定容至 200 mL，搖勻，得濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 吸收波長的選擇：根據(jù)文獻(xiàn)方法[8]精密量取蘆丁對照品液5.0 ml至25 ml容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH溶液 4 mL，加70%乙醇 0.4 mL，搖勻，放置 15 min，置于比色皿中，在波長400～600 nm之間測定吸光度，結(jié)果最大吸收波長在510 nm。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于 6只 15 mL具 塞 試 管中，分別加 70%乙醇至 5 ml，加 5%NaNO2溶液 0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH溶液 4 mL，加 70%乙醇0.4 mL，搖勻，放置 15 min，于 510 nm波長處以第一支試管溶液為空白對照，測定吸光度，結(jié)果見表1。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程 A=11.238C-0.0022，r=0.99928。

表1 濃度與吸光度

2.1.4 光石韋中總黃酮的提取和含量測定：將光石韋洗凈，低溫烘干，用電動植物粉碎機(jī)粉碎。稱取100 g于燒杯中,加入石油醚浸泡過夜脫脂去色，然后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾渣風(fēng)干，得脫脂去色的光石韋樣品，精確稱取脫脂去色的光石韋樣品9份，每份 5.0 g，按照三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表2)的 9種提取方案，分別回流提取材料中的總黃酮，過濾收集濾液，將濾液減壓濃縮并回收乙醇，得浸膏。將浸膏在60℃下真空干燥，研碎后得光石韋總黃酮粗提物。精密稱取浸膏 10 mg，溶解，定容至 25 mL，精密量取 4 mL的供試品溶液，自“加 70%乙醇溶液至 5 mL……”同上，以 70%乙醇為空白試劑，在最大吸收波長處測定各供試液的吸光度，并計(jì)算總黃酮含量。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)：稱取脫脂去色的光石韋樣品5.0 g，利用正交實(shí)驗(yàn)選取的最佳方案制備供試品溶液。測定方法同上，連續(xù)測定5次。計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.28%，表明該方法精密度良好 。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn):取供試品溶液，于 10、20、30、40、50、60 min時(shí)測定吸收值。計(jì)算 60 min內(nèi)吸光度的RSD值為 0.30%，表明吸光度在60 min中內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn):稱取脫脂去色的光石韋樣品 6份，每份5.0 g，按正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，再按“2.1.4樣品含量測定”項(xiàng)進(jìn)行分析，計(jì)算樣品中總黃酮含量的 RSD值為 2.10%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.1.8 回收率實(shí)驗(yàn):精密稱取已知總黃酮含量的光石韋樣品 6份，每份5.0 g，加入適量標(biāo)準(zhǔn)品，按正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，再按“2.1.4樣品含量測定”項(xiàng)進(jìn)行測定，經(jīng)計(jì)算得平均回收率為 99.00%，RSD值為2.20%，表明回收率良好。

2.2 提取工藝的優(yōu)選

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：為了系統(tǒng)考察乙醇提取法的條件參數(shù)，確定乙醇提取光石韋中黃酮的最佳工藝條件，我們選擇以總黃酮得率為考察指標(biāo)，將各考察因素取3個(gè)水平進(jìn)行了L9(34)正交試驗(yàn)，以考察乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間對總黃酮得率的影響。因素水平表見表2。

表2 因素水平表

總黃酮提取正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見表3。由表3中極差分析可知，各因素依次為A>B>C>D，以A2B2C2D1最佳。

2.2.2 工藝的驗(yàn)證試驗(yàn):精密稱取脫脂去色的光石韋樣品 3份，每份5.0 g。按上述正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，再按“2.1.4樣品含量測定”項(xiàng)下進(jìn)行分析，計(jì)算總黃酮含量得光石韋中總黃酮的平均含量為6.803%，RSD值為 1.72%(見表4)。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，是石韋等許多中草藥的有效成分，具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等功效[9]。如何利用有限的光石韋資源，得到最高的黃酮產(chǎn)量是很有意義的。本文根據(jù)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)從光石韋中提取總黃酮，其優(yōu)選的最佳工藝條件為：料液比為1:20的55%乙醇，回流提取2次，每次2 h。測得光石韋中總黃酮的平均含量為6.803%。比文獻(xiàn)報(bào)道的廬山石韋[7]，石韋[6]中的總黃酮含量高。不同種石韋總黃酮含量存在顯著差別，而總黃酮含量的巨大差別啟示不同種石韋可能具有不同的藥用功效，相關(guān)的工作值得進(jìn)一步研究。

[1]江蘇省植物研究所.新華本草綱目(第三冊)[M].上海:上?？萍汲霭嫔?1991:715.

[2]潘爐臺,趙俊華,孫慶文.貴州藥用蕨類植物[M].貴州:貴州科學(xué)出版社,2012:312.

[3]謝來成.武當(dāng)山藥用植物第一卷[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2006:98-99.

[4]Parallade J,Guinea M.Flavonoid inhibitors of trypsin and leucineaminopeptidase:A proposed mathematical model for IC50 estimation[J].J Nat Prod,1995,58(6):823-829.

[5]劉昌孝.藥物評價(jià)學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:107-113.

[6]王自軍,楊紅兵,齊譽(yù),等.正交設(shè)計(jì)研究石韋總黃酮和鞣質(zhì)提取工藝[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2007,18(2):463.

[7]王瑞蘭,易俗,陳康貴,等.廬山石韋中黃酮的提取工藝研究[J].長沙電力學(xué)院學(xué)報(bào),2003,18(4):84-86.

[8]李曉丹,肖婭萍.5種藥用石韋總黃酮的提取及測定[J].中國野生植物資源,2009,28(1):59-61.

[9]索朗其美,達(dá)瓦潘多,劉青,等.紫外分光光度法測定西藏野生和人工種植喜馬拉雅紫茉莉中總黃酮含量[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2012,4:60-62.