孫曉東 王 原 代素梅 張紹華 王海波 楊照環(huán) 劉華群 侯秀珍 于翠萍(唐山市工人醫(yī)院腫瘤科，河北 唐山 063000)

單核細胞是機體先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的重要成員之一〔1〕。單核細胞的異常發(fā)育，必然導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)功能和機體內(nèi)環(huán)境紊亂，引發(fā)多種疾病。骨髓造血干細胞分化為單核細胞受多種細胞因子影響，其中表皮生長因子(EGF)是骨髓造血干細胞分化的重要生長因子，可以促進成纖維細胞、間充質(zhì)細胞和腫瘤細胞產(chǎn)生一些趨化因子，尤其是單核細胞趨化因子(MCP-1)蛋白。作為單核巨噬細胞特異性的趨化因子，MCP-1在誘導(dǎo)單核細胞成熟、趨化以及參與炎癥和腫瘤組織浸潤等生物學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用〔2〕。厄洛替尼作為EGF受體的特異性抑制劑已經(jīng)在臨床中廣為使用，多數(shù)癌癥患者從中受益。然而，厄洛替尼是否能夠通過抑制EGF對單核細胞的作用，從而改變單核巨噬細胞的功能活性是本研究擬解決的問題。

1 材料與方法

1.1 單核細胞培養(yǎng) 把單核細胞系RAW264.7(購自美國ATCC)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，懸浮于含10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)2 h，收集未貼壁細胞置于新的培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細胞密度至1×106/ml，用于單核細胞的傳代培養(yǎng)。將離體培養(yǎng)的單核細胞分為四組:空白對照組、EGF處理組、厄洛替尼處理組、EGF聯(lián)合厄洛替尼處理組。EGF、厄洛替尼作用濃度分別為 10 ng/ml、4 μmol/L。聯(lián)合組為EGF先作用24 h后再加厄洛替尼作用4 h。

1.2 方法

1.2.1 噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖變化 調(diào)節(jié)RAW264.7細胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染方法和轉(zhuǎn)染后處理同前。轉(zhuǎn)染后48 h各組棄培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，輕輕吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度(OD)值，計算各組細胞抑制率 =〔(空白對照組 OD值－各實驗組OD值)/空白對照組OD值〕×100%。

1.2.2 單核細胞凋亡的檢測 采用流式細胞儀DNA倍體分析法。取對數(shù)生長期的以上四組細胞，胰酶消化，用PBS液洗2次后加入70%冷乙醇2 ml混勻，4℃固定30 min。再以1 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次，置于4℃室溫避光反應(yīng)15 min;在1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測，結(jié)果用Muticycle軟件系統(tǒng)進行分析，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Western印跡檢測核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的p65蛋白水

平 收集各組細胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清測定濃度后－80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ榛蛩徕c-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉，后放入含一抗的Tris鹽酸緩沖液(TBST)溶液，4℃過夜，洗膜，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)1 h，目標(biāo)蛋白質(zhì)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。計算機掃描，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白做參照，分析處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，組間均數(shù)比較用兩樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 厄洛替尼對單核細胞生長的抑制情況 厄洛替尼對人單核細胞的生長具有抑制作用，不同濃度的厄洛替尼對單核細胞均有抑制性，其抑制作用具有明顯的劑量和時間依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 厄洛替尼作用單核細胞的抑制率(%)

2.2 厄洛替尼對細胞凋亡的影響 空白對照組、EGF處理組、厄洛替尼處理組、EGF聯(lián)合厄洛替尼處理組的凋亡率分別為5.43% ±0.67%、12.1% ±1.56%、25.3% ±0.37%和33.2% ±1.37%，析因設(shè)計方差分析各組間差異顯著(P＜0.05)。

2.3 Western印跡結(jié)果 厄洛替尼可以顯著地抑制單核細胞分泌NF-κB，進而誘導(dǎo)單核細胞的凋亡。

3 討論

單核細胞的分化發(fā)育是一個復(fù)雜的生命過程，其中涉及多種信號途徑的協(xié)同和調(diào)控。某些細胞因子，如白細胞介素(IL)可刺激多能干細胞向髓樣干細胞分化〔3〕，而巨噬細胞集落因子(GM-CSF)能促使髓樣干細胞進一步分化為單核細胞〔4〕。外周血單核細胞在GM-CSF和IL-4的共同作用下可以在體外分化為樹突細胞，Chomarat等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)IL-6可以抑制單核細胞向樹突細胞方向分化，同時促進其向巨噬細胞分化。在腫瘤發(fā)展過程中，炎癥性單核巨噬細胞浸潤起著一定作用。而目前發(fā)現(xiàn)給予厄洛替尼處理后，EGF對單核細胞的凋亡具有抑制作用，并在抑制單核細胞凋亡進而抑制單核巨噬細胞趨化過程中得以體現(xiàn)，從一個較新的角度提示厄洛替尼對EGF受體相關(guān)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的抑制作用，為臨床治療腫瘤提供了一種新的思路和探索。

本研究結(jié)果顯示，厄洛替尼抑制單核細胞凋亡，通過抑制其分泌NF-κB因子，進而誘導(dǎo)單核細胞的凋亡。NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，從而啟動多種基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB因子是一種重要的細胞內(nèi)信號因子，由P50和P65組成二聚體，調(diào)節(jié)許多與細胞生長和分化相關(guān)的基因表達〔6〕。在多種人類腫瘤中NF-κB促進腫瘤的惡性化是多方面的，其調(diào)控的靶基因參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、血管生成和腫瘤的抗凋亡〔7〕。NF-κB調(diào)節(jié)單核細胞的經(jīng)典途徑為，未激活的NF-κB以P50/65-IκBα二聚體形式儲存于胞漿中。在外界條件刺激下，IκBα發(fā)生磷酸化降解，導(dǎo)致P50/65核定位序列(NLS)暴露〔8〕。在腫瘤發(fā)展過程中，NF-κB可以促進腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥性單核巨噬細胞浸潤。而給予厄洛替尼處理后，EGF對單核細胞分泌NF-κB具有抑制作用，這種作用在單核巨噬細胞趨化過程中得以體現(xiàn)。

本研究表明，厄洛替尼可以有效抑制單核細胞凋亡和遷移，進而調(diào)控單核細胞的分化。這一結(jié)果闡明了厄洛替尼對單核細胞分化的調(diào)控，進一步從細胞水平為其抗腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的抑制作用提供依據(jù)。

1 Hume DA，Ross IL，Himes SR，et al.The mononuclear phagocyte system revisited〔J〕.J Leukoc Biol，2002;72(4):621-7.

2 Saito S，Nakayama T，Hashimoto N，et al.Mesenchymal stem cells stably transduced with a dominant-negative inhibitor of CCL2 greatly attenuate bleomycin-induced lung damage〔J〕.Am J Pathol，2011;179(3):1088-94.

3 Storozynsky E，Woodward JG，F(xiàn)relinger JG，et al.Interleukin-3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhance the generation and function of dendritic cells〔J〕.Immunology，1999;97(1):138-49.

4 Sallusto F，Nicolò C，De Maria R，et al.Ceramide inhibits antigen uptake and presentation by dendritic cells〔J〕.J Exp Med，1996;184(6):2411-6.

5 Chomarat P，Dantin C，Bennett L，et al.TNF skews monocyte differentiation from macrophages to dendritic cells〔J〕.J Immunol，2003;171(5):2262-9.

6 Egan LJ，Toruner M.NF-κB signaling:pros and cons of altering NF-κB as a therapeutic approach〔J〕.Ann N Y Acad Sei，2006;1072(8):114-22.

7 黃 虎，胡義德，栗 娜，等.NF-κB、cyclin D1和p27在非小細胞肺癌中的表達及意義〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2008;16(5):737-40.

8 王 林，陳 紅，王 原，等.吉非替尼對臍帶來源間充質(zhì)干細胞表達MCP-1的抑制作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(24):4788-9.