陳奕涵 錢(qián)悅 侯永泰 周慶瑋 甘人寶 管世敏 榮紹豐

透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid，HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖與葡萄糖醛酸為雙糖單位等摩爾聚合而成的酸性黏多糖［1］，相對(duì)平均分子量多在104-107Da之間，不同分子量的HA具有不同的應(yīng)用領(lǐng)域，由于HA獨(dú)特的黏彈性和生理功能，HA已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域。

C類的獸疫鏈球菌和馬疫鏈球菌都可以合成HA，鑒于HA在發(fā)酵液中以游離狀態(tài)存在，具有易于分離純化和工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此目前工業(yè)上主要采取發(fā)酵法獲取HA。然而鏈球菌對(duì)于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件要求苛刻及不同HA分子量難于通過(guò)代謝調(diào)控獲得等劣勢(shì)已展現(xiàn)出來(lái)，以傳統(tǒng)的工藝優(yōu)化難以滿足市場(chǎng)需求。由于基因工程手段構(gòu)建工程菌表達(dá)HA則具有成本低，便于代謝調(diào)控以及下游純化工藝便捷等優(yōu)點(diǎn)，已成為未來(lái)工業(yè)化獲取HA的首選方法。研究表明，has操縱子在鏈球菌中的表達(dá)是合成HA所必需的，has操縱子是由3個(gè)基因hasA、hasB/ugd和hasC組成，分別編碼HA合成酶、UDP-葡萄糖脫氫酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，對(duì)于HA合成代謝具有顯著影響的則是hasA和hasB/ugd基因。將hasA與hasB/ugd基因?qū)氡磉_(dá)菌株并在適宜的培養(yǎng)條件下則可獲得 HA［2，3］。

UDP-葡萄糖脫氫酶（UDP-GlcDH）存在于動(dòng)物、植物與細(xì)菌中，可以將UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化成UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA），UDP-GlcA是形成結(jié)構(gòu)多糖和細(xì)胞生長(zhǎng)代謝必不缺少的前體物質(zhì)［4，5］。Sheng等［6］研究結(jié)果表明高活性的UDP-GlcDH更有利于HA的生成。PL啟動(dòng)子受λ噬菌體CI基因的調(diào)控，CI基因溫度敏感性突變體所產(chǎn)生的CI857阻遏蛋白在低溫30℃時(shí)候具有阻遏作用，在高于37℃時(shí)候阻遏蛋白失活并且解除阻遏，促使PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄［7］。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)大腸桿菌BL21（DE3）與YK537進(jìn)行ugd基因克隆，重組連接于含有PL啟動(dòng)子的pBLMVL2載體上，分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）與YK537中進(jìn)行升溫誘導(dǎo)表達(dá)，考察不同菌株的UDPGlcDH的酶活，旨在為后續(xù)利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)來(lái)自鏈球菌的hasA基因以及超表達(dá)大腸桿菌ugd基因，并最終合成HA奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌種 質(zhì)粒pBLMVL2（內(nèi)含PL啟動(dòng)子，SD序列）、大腸桿菌（Escherichia .coli）TOP10、BL21（DE3）與YK537均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 本試驗(yàn)所用化學(xué)分析純?cè)噭┵?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自上海生工；Pyrobest DNA polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase等購(gòu)自大連寶生物公司；UDP-葡萄糖和NAD＋購(gòu)自Sigma公司。Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和抗生素 大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)；重組表達(dá)株采用M9CAA培養(yǎng)基（含1％酸水解酪蛋白和1％葡萄糖的M9培養(yǎng)基），氨芐青霉素濃度為 100μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 取大腸桿菌BL21（DE3）與YK537甘油菌轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，次日參照DNA抽提試劑盒方法提取基因組總DNA，并用紫外分光光度計(jì)驗(yàn)證其純度。

1.2.2 大腸桿菌ugd基因引物設(shè)計(jì)與PCR 通過(guò)對(duì)NCBI中已公布的大腸桿菌CFT073（NC_004311），大 腸 桿 菌 BL21（DE3）（NC_012971.2，NC_01289-2.2），大腸桿菌K-12（NC_000913）的ugd基因的保守序列對(duì)比，設(shè)計(jì)出ugd基因的上游引物和下游引物，上游引物：5'-GGATCCATGAAAATCACCATTTCCGGTA-3'（內(nèi)含BamH I位點(diǎn)），下游引物：5'-CCCAAGCTTATTAGTCGCTGCCAAAGAGATCG-3'（內(nèi)含Hind Ⅲ位點(diǎn)），引物合成由上海生工完成。

分別以BL21（DE3）與YK537的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min 30s，共32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。參照PCR產(chǎn)物純化試劑盒要求回收ugd基因。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用EcoR I酶切處理質(zhì)粒pBLMVL2，將處理后的開(kāi)環(huán)質(zhì)粒再采用Mung Bean Nuclease進(jìn)行黏性末端的平滑化，平滑化后放入65℃水浴15min熱處理再采用Hind Ⅲ酶切，最后采用低熔點(diǎn)膠電泳分離并使用膠回收試劑盒回收處理后載體，對(duì)PCR回收后的ugd基因采用Hind Ⅲ單酶切，將以上處理完的載體和ugd基因采用T4 DNA Ligase進(jìn)行16℃過(guò)夜連接，次日轉(zhuǎn)化到E.coli TOP10中涂布于氨芐平板（含氨芐青霉素100μg/mL）并進(jìn)行挑選單克隆，對(duì)抽提質(zhì)粒進(jìn)行采用BamH I、HindⅢ雙酶切和PCR鑒定，重組質(zhì)粒測(cè)序工作由上海生工完成，篩選出目的基因來(lái)自E.coli BL21（DE3）的重組質(zhì)粒pBLBugd，目的基因來(lái)自E.coli YK537的重組質(zhì)粒pBLYugd。

1.2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá) 將pBLBugd、pBLYugd分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）與YK537中，獲得 重 組 菌 BL21（DE3）（pBLBugd）、BL21（DE3）（pBLYugd）、YK537（pBLBugd）和 YK537（pBLYugd）。將對(duì)照組BL21（DE3）（pBLMVL2）與以上4株重組菌先接種到LB培養(yǎng)基中37℃，200r/min培養(yǎng)12h，緊接著按照2％的接種量分別轉(zhuǎn)接到M9CAA培養(yǎng)基中30℃，200r/min培養(yǎng)12h，次日按照10％接種量分別再次轉(zhuǎn)接到M9CAA搖瓶培養(yǎng)基中，35℃，200r/min培養(yǎng)2h后分別升溫到38℃、40℃、42℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以上培養(yǎng)條件均采用100μg/mL氨芐青霉素穩(wěn)定質(zhì)粒。在38℃、40℃、42℃誘導(dǎo)條件下，將對(duì)照組BL21（DE3）（pBLMVL2）和以上4株重組菌分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后6h菌液12000r/min離心10min，棄上清后采用等體積PBS（pH7.5，10mmol/L）溶液重懸浮后離心取沉淀，棄上清加入15μL 2×SDS loading buffer，煮沸5min后離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 UDP-葡萄糖脫氫酶酶活的測(cè)定 分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)一定時(shí)間后菌液3mL在12000r/min離心，棄上清后在4℃條件下重懸浮于1mL PBS（pH7.5，10mmol/L）溶液中，在冰浴條件下選取300 V電壓，超聲3 s間歇5 s對(duì)其進(jìn)行超聲破碎20min，離心取上清作為粗提液。以1mL反應(yīng)體系為酶活測(cè)定體系，其中包括5mmol/L UDP-葡萄糖，5mmol/L NAD＋，100mmol/L Tris-HCl（pH8.0）及 5μL 粗酶液［8］。酶活反應(yīng)在30℃下進(jìn)行，用紫外分光光度計(jì)（UV-2100 spectrophotometer）檢測(cè)340nm處吸光度的增加來(lái)確定反應(yīng)體系中NADH的生成，酶活的定義為30℃條件下該反應(yīng)體系中每分鐘生成2μmol NADH為1 U［9］。蛋白的濃度采用Brandford方法測(cè)定。

1.2.6 UDP-葡萄糖脫氫酶比酶活的計(jì)算 UDPGlcDH酶活的計(jì)算根據(jù)根據(jù)朗波爾定律ΔA=εCL和酶活定義，其中ΔA為酶促反應(yīng)初期一分鐘吸光度的增加值，ε為NADH在340nm處的摩爾吸光系數(shù)，C為NADH濃度，L為比色皿厚度，本試驗(yàn)中ε取NADH 微摩爾消光系數(shù)為 0.0062 （μmol/L）-1·cm-1［10］。本試驗(yàn)測(cè)定酶活體系為1mL（Vt），加入超聲后粗酶液是為5μL（Ve），比色皿厚度為1cm，其中參照Brandford方法測(cè)定粗蛋白濃度為Cp（mg/mL），則 有 比 酶 活（U/mg）=ΔA·Vt/（2εL·Ve·Cp），將本試驗(yàn)體系代入數(shù)值即為UDP-GlcDH比酶活的計(jì)算公式：U/mg=ΔA/（0.062×Cp）。

2 結(jié)果

2.1 UDP-葡萄糖脫氫酶基因ugd的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的驗(yàn)證

從 BL21（DE3） 與 YK537基 因 組 總 DNA 中PCR擴(kuò)增得到的基因分別為Bugd與Yugd，瓊脂糖凝膠電泳后可以在目的條帶處觀察到清晰條帶（圖1），將重組質(zhì)粒分別進(jìn)行BamH I/Hind Ⅲ雙酶切后電泳在1.2 kb和5.2 kb處出現(xiàn)兩條清晰條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)果表明目的基因已成功連接到質(zhì)粒pBLMVL2中。

圖1 ugd基因的PCR電泳結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

2.2 ugd基因序列的測(cè)定與序列比對(duì)

采用PL啟動(dòng)子序列分別對(duì)pBLBugd和pBLYugd進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果（圖3）表明，Bugd基因與GenBank中NC_012971序列完全一致，測(cè)序獲得Yugd基因上傳NCBI并獲得序列號(hào)JX187363，將其與Bugd基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列對(duì)比，核苷酸序列對(duì)照結(jié)果顯示Yugd基因與Bugd基因同源性為98.37％，氨基酸同源性為99.74％，僅在184位氨基酸出現(xiàn)差異（圖片未顯示），以上結(jié)果表明已成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒pBLBugd和pBLYugd。

圖3 克隆得到的Yugd基因序列

2.3 ugd基因保守區(qū)段的分析

利用NCBI在線軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）對(duì)Yugd序列進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）表明，Yugd氨基酸序列屬于典型UDP-葡萄糖/GDP-甘露糖脫氫酶家族，它具有3個(gè)典型的區(qū)域，分別是N端的NAD＋結(jié)合區(qū)（2-83）和C端的NAD＋結(jié)合區(qū)（300-385），中間部分為UDP-葡萄糖/GDP-甘露糖脫氫酶中央結(jié)構(gòu)域（191-280）。Bugd氨基酸序列采用在線軟件分析后結(jié)果與Yugd一致，以上3個(gè)典型的區(qū)域分布也說(shuō)明了184位氨基酸差異為無(wú)義突變引起，不會(huì)顯著影響UDP-葡萄糖脫氫酶的活性。

圖4 ugd基因保守區(qū)段的分析

2.4 ugd基因在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pBLBugd和pBLYugd分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）與YK537，所得重組菌在38℃、40℃、42℃升溫誘導(dǎo)條件下穩(wěn)定地表達(dá)ugd基因，經(jīng)SDS-PAGE分析（圖5），在43kD條帶處較誘導(dǎo)前均出現(xiàn)明顯蛋白條帶，與大腸桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶理論分子量43.6kD基本相當(dāng)。

2.5 對(duì)影響重組表達(dá)UDP-葡萄糖脫氫酶（UDPGlcDH）活性的因素分析結(jié)果

2.5.1 恒定誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌表達(dá)UDP-GlcDH活性的影響 含有空載體的BL21（DE3）（pBLMV2）具有宿主菌BL21（DE3）自身的ugd基因，但是由于其微量表達(dá)和測(cè)定體系靈敏度等原因，在本酶活測(cè)定中未檢測(cè)到UDP-GlcDH酶活，而含有pBLBugd與pBLYugd重組質(zhì)粒的表達(dá)株均獲得高活性UDPGlcDH的表達(dá)（圖6）。在38℃誘導(dǎo)條件下UDPGlcDH比酶活在升溫誘導(dǎo)6h均達(dá)到最大，且38℃誘導(dǎo)條件下表達(dá)UDP-GlcDH采用BL21（DE3）較優(yōu)于YK537。在40℃誘導(dǎo)條件下，BL21（DE3）（pBLBugd）與YK537（pBLYugd）在升溫誘導(dǎo)4h時(shí)達(dá)到比酶活最大值，而B(niǎo)L21（DE3）（pBLYugd）與YK537（pBLBugd）在升溫誘導(dǎo)6h時(shí)達(dá)到比酶活最大值；在42℃升溫誘導(dǎo)條件下，YK537（pBLYugd）在升溫誘導(dǎo)4h后獲得比酶活最大值，另外3株重組菌在6h后獲得最佳比酶活。

2.5.2 兩階段溫度誘導(dǎo)對(duì)重組菌表達(dá)UDP-葡萄糖脫氫酶（UDP-GlcDH）活性的影響 為了兼顧UDPGlcDH的高活性表達(dá)、透明質(zhì)酸合成酶的胞內(nèi)表達(dá)活性以及HA的合成對(duì)胞內(nèi)環(huán)境溫度的要求，考察了兩階段溫度誘導(dǎo)表達(dá)UDP-GlcDH的兩種方法：①先升溫至40℃誘導(dǎo)1h后降溫至38℃繼續(xù)誘導(dǎo)；②先升溫至42℃誘導(dǎo)1h后降溫至38℃繼續(xù)誘導(dǎo)。結(jié)果（圖7）表明，兩階段溫度誘導(dǎo)4株重組菌均在誘導(dǎo)6h達(dá)到酶活最大值，較恒定溫度誘導(dǎo)條件下UDP-GlcDH酶活均有了提高，其中先升溫至42℃誘導(dǎo)1h后降溫至38℃繼續(xù)誘導(dǎo)更適于高活性UDPGlcDH的表達(dá)。

圖5 UDP-葡萄糖脫氫酶蛋白電泳分析

2.5.3 酵母粉對(duì)重組表達(dá)UDP-葡萄糖脫氫酶（UDPGlcDH）活性的影響 在兩階段溫度誘導(dǎo)方法的基礎(chǔ)上，在42℃升溫前1h，向M9CAA培養(yǎng)基中加入1％的酵母粉，然后42℃升溫誘導(dǎo)1h后降溫至38℃誘導(dǎo)表達(dá)使得UDP-GlcDH活性得到顯著提高（圖8），同時(shí)也相對(duì)延長(zhǎng)了UDP-GlcDH在胞內(nèi)的保持活性的持續(xù)時(shí)間。

圖6 不同誘導(dǎo)溫度下重組菌表達(dá)UDP-GlcDH酶活與升溫誘導(dǎo)時(shí)間關(guān)系

3 討論

由于大腸桿菌具有遺傳背景清楚，表達(dá)體系穩(wěn)定以及大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，常用作外源基因表達(dá)的高效宿主，采用大腸桿菌體系是獲得穩(wěn)定高效地表達(dá)HA較好的選擇［11-13］。IPTG作為tac啟動(dòng)子與trc啟動(dòng)子常用的誘導(dǎo)物，礙于IPTG的毒害性以及成本因素的考慮此誘導(dǎo)體系僅僅只能適用于基礎(chǔ)研究，PL啟動(dòng)子與trp啟動(dòng)子由于成本低廉常用作大規(guī)模表達(dá)體系的誘導(dǎo)，尤其是PL同時(shí)作為受到嚴(yán)格控制的溫敏型轉(zhuǎn)錄強(qiáng)啟動(dòng)子，用于多種目的產(chǎn)物的表達(dá)，已具有顯著優(yōu)勢(shì)［14］。我們采用在38℃、40℃、42℃溫度條件下分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)所購(gòu)建的重組菌，獲得不同活性的UDP-GlcDH，推測(cè)原因主要是在38℃誘導(dǎo)條件下，體系已經(jīng)顯著抑制阻遏蛋白CI857的活性，目的基因已開(kāi)始表達(dá)，雖然Bugd與Yugd在基因序列上有1.63％的差異性，但在38℃誘導(dǎo)溫度下由于PL啟動(dòng)子的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率沒(méi)有充分得到釋放，因基因序列上的差異性而引起目的基因在翻譯過(guò)程中密碼子的偏好性未展現(xiàn)出來(lái)，4株重組菌均在誘導(dǎo)6h時(shí)候獲得比酶活最大值；40℃誘導(dǎo)結(jié)果表明，因目的基因的差異性而顯示翻譯過(guò)程中密碼子的偏好性已得到體現(xiàn)，以致出現(xiàn)BL21（DE3）（pBLBugd）與YK537（pBLYugd）表達(dá)酶活的相對(duì)滯后現(xiàn)象；文獻(xiàn)報(bào)道，在42℃條件下由于PL啟動(dòng)子獲得高效率轉(zhuǎn)錄，以BL21（DE3）為宿主菌表達(dá)效率較優(yōu)于 YK537［15］，故在本試驗(yàn) BL21（DE3）的表達(dá)體系中，由于目的產(chǎn)物瞬時(shí)表達(dá)量過(guò)高而以致形成大量包涵體，導(dǎo)致上清液中可溶性UDP-GlcDH較少?gòu)亩绊懥嗣傅谋然?，而YK537在表達(dá)Yugd基因時(shí)，由于不是最佳宿主，反而因?yàn)楸磉_(dá)UDPGlcDH速率相對(duì)較低，在兼顧表達(dá)自身Yugd基因優(yōu)勢(shì)的條件下，擁有更為充足的時(shí)間去完成重組蛋白的折疊和修飾，大量UDP-GlcDH以可溶性形式存在，出現(xiàn)42℃條件下YK537（pBLYugd）在升溫誘導(dǎo)4h后獲得酶活最大值，同時(shí)高于其它兩個(gè)溫度誘導(dǎo)條件下的比酶活值，而B(niǎo)L21（DE3）（pBLBugd）即使表達(dá)自身基因Bugd也沒(méi)有像40℃條件下4h即可達(dá)到比酶活較大值，主要原因可能由于包涵體的存在影響了UDP-GlcDH的比酶活。在升溫誘導(dǎo)的后期，重組蛋白的大量表達(dá)和高溫誘導(dǎo)條件下的熱誘導(dǎo)會(huì)產(chǎn)生熱休克蛋白，而研究表明熱休克蛋白中含有許多蛋白水解酶［16，17］，會(huì)降解部分重組蛋白，從而可能引起在升溫誘導(dǎo)一段時(shí)間后出現(xiàn)UDP-GlcDH的活性下降。

圖7 兩階段誘導(dǎo)條件下重組菌表達(dá)UDP-GlcDH酶活與誘導(dǎo)時(shí)間關(guān)系

圖8 雙階段誘導(dǎo)并添加酵母粉條件下重組菌表達(dá)UDPGlcDH酶活與誘導(dǎo)時(shí)間關(guān)系

近年來(lái)Mao采用巴斯德桿菌提供hasA基因，大腸桿菌K5菌株提供ugd基因，在大腸桿菌內(nèi)獲得了HA的表達(dá)，但是誘導(dǎo)體系中采用IPTG作為誘導(dǎo)物，Liang等采用了NICE控制系統(tǒng)在乳酸乳球菌中成功表達(dá)了HA，Sheng等也在乳酸乳球菌中使用Nisin和乳糖作為誘導(dǎo)劑，分別誘導(dǎo)含hasA質(zhì)粒和 hasB 質(zhì)粒進(jìn)行差異化表達(dá) HA［2，6，13］，終究礙于誘導(dǎo)條件的制約僅僅只能用作基礎(chǔ)研究。本試驗(yàn)采用PL啟動(dòng)子升溫誘導(dǎo)自身ugd基因表達(dá)HA的關(guān)鍵酶UDP-GlcDH，在不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)UDP-GlcDH的比酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于張晉宇等［23］采用T7啟動(dòng)子在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)獸疫鏈球菌的UDP-GlcDH比酶活；UDP-GlcA的含量是形成HA的關(guān)鍵限制因素，而高活性的UDP-GlcDH和一定的酶活持續(xù)時(shí)間則是產(chǎn)生大量UDP-GlcA的必需條件。PL啟動(dòng)子采用升溫誘導(dǎo)方式具有大規(guī)模工業(yè)化表達(dá)目的產(chǎn)物的優(yōu)勢(shì)，避免化學(xué)誘導(dǎo)劑的缺陷，有利于下游HA的分離純化，即使對(duì)于大規(guī)模發(fā)酵升溫誘導(dǎo)方式具有傳熱效率較為緩慢的弊端，然而緩慢升溫誘導(dǎo)反而更利于目的產(chǎn)物的表達(dá)［24］，在此基礎(chǔ)之上本研究確定了兩階段升溫誘導(dǎo)方式可以顯著提高UDP-GlcDH活性，延長(zhǎng)UDP-GlcDH在胞內(nèi)保持高活性的持續(xù)時(shí)間，從而為后續(xù)hasA基因參與大腸桿菌中采用雙質(zhì)粒差異性誘導(dǎo)表達(dá)HA提供了依據(jù)，為HA的鏈延伸提供了充足的時(shí)間。

4 結(jié)論

分別克隆了大腸桿菌BL21（DE3）與YK537的ugd基因，并采用PL啟動(dòng)子在不同條件下升溫誘導(dǎo)表達(dá)UDP-GlcDH，顯著高于已有報(bào)道中采用大腸桿菌表達(dá)獸疫鏈球菌或者馬疫鏈球菌hasB基因的UDP-GlcDH活性。

兩階段升溫誘導(dǎo)較恒定溫度誘導(dǎo)條件下可以減少包涵體的形成，在一定程度上提高了UDP-GlcDH活性和延長(zhǎng)了UDP-GlcDH在胞內(nèi)的持續(xù)時(shí)間。

兩階段升溫誘導(dǎo)前1h，向M9CAA培養(yǎng)基中加入1％的酵母粉，然后42℃升溫誘導(dǎo)1h后降溫至38℃誘導(dǎo)表達(dá)，可以使UDP-GlcDH活性得到最佳表達(dá)。

［1］ Chong BF, Blank LM, Mclaughlin R, et al.Microbialhyaluronic acid production ［J］.Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66：341-351.

［2］ Chien LJ, Lee CK.Hyaluronic acid production by recombinant Lactococcus lactis ［J］.Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 77：339-346.

［3］ Yu HM, Stephanopoulos G.Metabolic engineering of Escherichia coli for biosynthesis ofhyaluronic acid ［J］.Metabolic Engineering,2008, 10（1）：24-32.

［4］ Blanch M, Vicente IC, Pi?ón D.Sugarcane glycoproteins are required to the production of an active UDP-glucose dehydrogenase by Xanthomonas albilineans ［J］.Ann Microbiol, 2007, 57（2）：217-221.

［5］ Clarkin CE, Allen S, Wheeler-Jones CP, et al.Reduced chondrogenicmatrix accumulation by 4-methylumbelliferone reveals the potential for selective targeting of UDP-glucose dehydrogenase ［J］.Matrix Biology, 2011, 30（3）：163-168.

［6］ Sheng JZ, Ling PX, Zhu XQ, et al.Use of induction promoters to regulatehyaluronan synthase and UDP-glucose-6-dehydrogenase of Streptococcus zooepidemicus expression in Lactococcus lactis：a case study of the regulationmechanism ofhyaluronic acid polymer ［J］.Journal of Applied Microbiology, 2009, 107（1）：136-144.

［7］ Soares CRJ, Ueda EKM, Oliveira TL, et al.Human prolactin（hPRL）and growthhormone（hGH）distinct behavior under bacteriophage lambda PLpromoter control ［C］.The 4th Recombinant Protein Production Meeting：a comparative view onhost physiology Barcelona, Spain, 2006：21-23.

［8］ K?rk?nen A, Murigneux A, Martinant JP, et al.UDP-glucose dehydrogenases ofmaize：a role in cell wall pentose biosynthesis ［J］.Biochem, 2005, 391（Pt2）：409-415.

［9］ Doughert BA, Rijn IVD.Molecular characterization ofhasB from an operon required forhyaluronic acid synthesis in group A Streptococci［J］.Biochemistry, 1993, 288（10）：7128-7124.

［10］ Kiianitsa K, Solinger JA, Heye WD.NADH-coupledmicroplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low andhigh specific activities ［J］.Analytical Biochemistry,2003, 321：266-271.

［11］ 朱筠, 李志敏, 張倩, 等.重組大腸桿菌BL21（pBAI）生產(chǎn)人干擾素α2b［J］.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2008, 34（2）：184-188.

［12］ Baneyx F.Recombinant protein expression in Escherichia coli ［J］.Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10：411-421.

［13］ Mao ZC, Shin HD, Chen R.A recombinant E.coli bioprocess forhyaluronan synthesis ［J］.Appl Microbiol Biotechnol, 2009（84）：63-69.

［14］ Makrides SC.Strategies for achievinghigh-Level expression of genes in Escherichia coli ［J］.Microbiological Reviews, 1996, 60（3）：512-538.

［15］ 聞崇瑋, 甘人寶, 朱尚權(quán).超活性胰高血糖素的分泌表達(dá)［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào), 2003, 35（2）：167-171.

［16］ Villaverde A, Benito A, Viaplana E, et al.Fine regulation of CI857-controlled gene expression in continuous culture of recombinant Escherichia coli by temperature ［J］.Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59（10）：3485-3487.

［17］ Rosen R, Ron EZ.Proteome analysis in the study of the bacterialheat-shock response ［J］.Mass Spectrometry Reviews, 2002, 21（4）：244-265.

［18］ Guisbert E, Yura T, Rhodius VA, et al.Convergence ofmolecular,modeling, and systems approaches for an understanding of the Escherichia coliheat shock response ［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2008, 72（3）：545-554.

［19］ Oakey HJ, Owens L.A new bacteriophage, VHML, isolated from a toxin producing strain of Vibrioharveyi in tropical Australia ［J］.Applied Microbiology, 2000, 89（4）：702-709.

［20］ Liveris D, Mulay V, Schwartz I.Functional properties of Borrelia burgdorferi recA ［J］.Bacteriology, 2004, 186（8）：2275-2280.

［21］ 劉新平, 陳南春, 陳蘇民.誘導(dǎo)方式對(duì)PL啟動(dòng)子控制下人工合成心鈉素28肽基因轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)變化的影響［J］.生物化學(xué)雜志 , 1991, 7（1）：8-12.

［22］ Tabandeh F, Shojaosadati SA, Zomorodipour A, et al.Heatinduced production ofhuman growthhormone byhigh cell density cultivation of recombinant Escherichia coli ［J］.Biotechnology Letters, 2004, 26：245-250.

［23］ 張晉宇, 吳小明, 郝寧, 等.獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸合成相關(guān)基因hasB的克隆以及性質(zhì)研究［J］.中國(guó)生物工程雜志, 2005,25（7）：86-91.

［24］ Caspeta L, Flores N, Pérez NO, et al.The effect ofheating rate on Escherichia colimetabolism, physiological stress,transcriptional response, and production of temperature-induced recombinant protein：a scale-down study ［J］.Biotechnology and Bioengineering, 2009, 102（2）：468-482.