肖金寶， 李洪斌， 劉福強(qiáng)， 王艷萍

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部，吉林延吉133000;2.解放軍第208醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130062)

銀杏葉制品已廣泛用于治療冠心病、心絞痛、大腦退化及腦血管疾病引起的腦功能障礙、老年癡呆等［1］。為了延長(zhǎng)銀杏葉制劑作用時(shí)間，減少用藥次數(shù)、降低毒性、提高療效，采用鼻腔給藥特別治療腦血管疾病，被認(rèn)為是較為理想的給藥途徑。其優(yōu)點(diǎn)有鼻黏膜內(nèi)的豐富血管和高度滲透性有利于吸收，避開首過(guò)效應(yīng)，吸收程度和速度可與靜脈相當(dāng)［2］。泊洛沙姆是溫敏型原位凝膠劑的常用基質(zhì)，泊洛沙姆407、188合用較常見(jiàn)［3］。本實(shí)驗(yàn)采用泊洛沙姆407、188以及殼聚糖為輔料研制了一種銀杏葉鼻用原位凝膠擬用于治療癡呆癥，并對(duì)其體外釋放特點(diǎn)進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

LC—10AVT高效液相色譜儀、SPD—10AV紫外檢測(cè)器 (日本島津公司);N2000雙道色譜工作站 (浙江大學(xué)智能信息工程研究所);AT—130柱溫箱 (天津市鑫州科技有限公司);THZ—82水浴恒溫振蕩器 (金壇市華城創(chuàng)威實(shí)驗(yàn)儀器廠);電熱恒溫水浴鍋 (北京市中興偉業(yè)儀器有限公司);PHS—3C精密酸度計(jì) (上海虹益儀器儀表有限公司);銀杏葉提取物 (西安瑞安生物工程有限公司);槲皮素對(duì)照品、山柰素對(duì)照品、異鼠李素對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為100081-200406、110861-200606、110860-200407);泊洛沙姆P188、P407(南京威爾化工有限公司，批號(hào)20111101);羥丙基-β環(huán)糊精 (HP-β-CD，西安德立生物化工有限公司，批號(hào)20110805)殼聚糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20110316);透析袋 (直徑為18 mm，相對(duì)分子質(zhì)量1 000 Solarbio Life Sciences);羊、牛鼻組織(長(zhǎng)春市皓月集團(tuán)生產(chǎn));甲醇為色譜純;其余試劑均為分析純;水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溫度敏感型原位凝膠溶液的制備

2.1.1 處方 銀杏葉提取物3 g，泊洛沙姆407 7.5 g，泊洛沙姆188 10 g，殼聚糖 200 mg，30%HP-β-CD8mL，0.05%尼泊金乙酯1 mL，維生素C 0.5 g，重蒸水適量。

2.1.2 制備 依照處方，精密稱取殼聚糖置已知質(zhì)量的100 mL燒杯中，加入適量2%醋酸溶液攪拌溶解后，加入適量重蒸水搖勻，分別稱取泊洛沙姆P407、P188依次分次加入其中，不斷攪拌使溶解，4℃放置24 h直至氣泡排盡即得;稱取銀杏葉提取物加入30%HP-β-CD溶液適量使其溶解，加入0.05%尼泊金乙酯，維生素C，攪拌使溶解，所得溶液加入到上述溶液中補(bǔ)重蒸水到50 g。

2.2 測(cè)定方法研究

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇 －0.4%磷酸(55∶45);體積流量 0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng) 360 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量20μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品適量，加入甲醇配制成每1 mL分別含0.03mg、0.03mg、0.02 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取銀杏葉提取物鼻用原位凝膠0.50 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入甲醇-25%HCl(4∶1)混合液35 mL，溶解搖勻，放入90℃恒溫水浴槽內(nèi)回流提取1 h，取出，放冷至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲處理?yè)u勻，提取液用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶 液 1.0 、2.5、4.0、5.0、5.5、7.0、7.5、8.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，在上述色譜條件進(jìn)樣20μL，測(cè)定。以進(jìn)樣量 (X)為橫坐標(biāo)，峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得槲皮素回歸方程Y=36 862X－33 995，r=0.999 0，線性范圍3.0～25.5μg/mL;山柰素Y=41 689X－30 133，r=0.999 4，線性范圍 3.0～25.5μg/mL;異鼠李素Y=37 447X－93 533，r=0.9 991，線性范圍1.2～25.5μg/mL。

2.2.5 回收率測(cè)定 精密稱取槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0.038、0.036、0.024 mg/mL混合對(duì)照品溶液。取銀杏葉提取物溫度敏感型鼻用原位凝膠9份，精密稱定，分別加入混合對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法制備。按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Recovery rate test results

2.2.6 精密度測(cè)定 精密吸取對(duì)照品溶液20μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，槲皮素、山柰素、異鼠李素的RSD分別為0.42%，0.25%，0.80%。說(shuō)明該方法適用于藥物釋放行為的考察。

2.3 人工鼻液的制備［4］精密稱取磷酸二氫鉀13.6 g，溶于適量重蒸水中，攪拌使其溶解，加重蒸水至1 000 mL，搖勻，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH為6.8。

2.4 體外藥物釋放行為考察 銀杏葉以及制劑中主要的活性成分是黃酮類化合物和銀杏葉內(nèi)酯，本實(shí)驗(yàn)以總黃酮為研究指標(biāo)進(jìn)行體外釋放度測(cè)定。

2.4.1 無(wú)膜溶出法［5-6］取銀杏葉提取物鼻用原位凝膠制劑50mL加入到稱定質(zhì)量的燒杯中，把燒杯置于 (37±0.5)℃的水浴恒溫振蕩器中，預(yù)熱20 min，使溶液完全形成凝膠。加入37℃的人工鼻液2.4 mL作為釋放介質(zhì)，小心操作保持凝膠表面完整。在一定頻率下恒溫振蕩20 min，把釋放介質(zhì)傾倒出來(lái)，把燒杯外表面擦干，稱定質(zhì)量并記錄，然后再放入水浴恒溫振蕩器中平衡20 min，依上法反復(fù)操作8次。以相鄰時(shí)間點(diǎn)樣品的質(zhì)量之差為凝膠溶蝕量。以凝膠累積溶蝕百分率對(duì)時(shí)間作圖，得凝膠溶蝕曲線。每一試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果求平均值。

將以上得到的釋放介質(zhì)用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾供HPLC分析，測(cè)定藥物濃度。以藥物累積釋放百分率對(duì)時(shí)間作圖，得到藥物釋放曲線。重復(fù)3次，結(jié)果求平均值。見(jiàn)圖1、2。

RSD分別為0.92%、0.85%。由圖1、2可知，凝膠溶蝕量較少，藥物釋放比較完全，且兩者的線性關(guān)系不明顯 (r=0.975)，表明凝膠中的藥物主要通過(guò)擴(kuò)散而不是溶蝕方式釋藥。

圖1 凝膠溶蝕曲線Fig.1 Gel dissolving curve

圖2 藥物釋放曲線Fig.2 Drug release curve

2.4.2 牛鼻黏膜透析試驗(yàn)［7］牛鼻黏膜的制備［8］:將宰殺2 h內(nèi)的牛鼻子取下，切開鼻腔，暴露出鼻中膈及兩側(cè)鼻甲骨，用鑷子將覆蓋其上的鼻腔黏膜小心剝離，用生理鹽水清洗干凈，將其平鋪在鋁箔上然后包好，－20℃冷凍儲(chǔ)備。

采用Franz擴(kuò)散池 (自制)，供給室與接收池容積均為7 mL，擴(kuò)散面積為0.97 cm2。接受池內(nèi)加入生理鹽水，把牛鼻黏膜的黏膜層向上固定在供給室與擴(kuò)散室之間，置溫度 (37±0.5)℃的水浴恒溫振蕩器中平衡20 min，取200μL原位凝膠均勻覆蓋黏膜上。分別于 15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min從接收池取樣 150 μL，每次取樣后補(bǔ)加生理鹽水150μL。樣品按上述色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定總黃酮的量，計(jì)算累積擴(kuò)散量 (Q)。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果求平均值，RSD為0.57%。見(jiàn)圖3。

圖3 銀杏葉提取物溫度敏感型鼻用原位凝膠牛鼻粘膜透析累積擴(kuò)散率-時(shí)間曲線Fig.3 Time-Ginkgo biloba extract temperature-sensitive nasal in situ gel though bovinemucosal cumulative diffusion rate curve

2.4.3 羊鼻黏膜透析試驗(yàn) 羊鼻黏膜的制備:將宰殺2 h內(nèi)的羊鼻子取下，切開鼻腔，暴露出鼻中膈及兩側(cè)鼻甲骨，用鑷子將覆蓋其上的鼻腔黏膜小心剝離，用生理鹽水清洗干凈，將其平鋪在鋁箔上然后包好，－20℃冷凍儲(chǔ)備。

采用Franz擴(kuò)散池 (自制)，供給室與接收池容積均為7 mL，擴(kuò)散面積為0.97 cm2。接受池內(nèi)加入生理鹽水，把羊鼻黏膜黏膜層向上固定在供給室與擴(kuò)散室之間，置于溫度 (37±0.5)℃的水浴恒溫振蕩器中平衡20 min，用定量加樣器使200μL原位凝膠均勻覆蓋黏膜上。分別于15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min從接收池取樣150μL，每次取樣后補(bǔ)加生理鹽水150μL。樣品按上述色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定總黃酮的量，計(jì)算累積擴(kuò)散量 (Q)。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果求平均值，RSD為0.63%。見(jiàn)圖4。

圖4 銀杏葉提取物溫度敏感型鼻用原位凝膠羊鼻黏膜透析累積擴(kuò)散率-時(shí)間曲線Fig.4 Time-Ginkgo biloba extract tem perature-sensitive nasal in situ gel though sheep mucosal cumulative diffusion rate curve

由圖3、圖4可知，銀杏葉提取物鼻用原位凝膠透牛鼻黏膜和透羊鼻黏膜累積擴(kuò)散率均已達(dá)到80%。數(shù)據(jù)分別用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程、和一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程等數(shù)學(xué)模型擬合，以一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合度最佳，相關(guān)系數(shù) r值為0.995 3與0.996 8。結(jié)果表明銀杏葉提取物鼻用原位凝膠中的藥物透生物膜擴(kuò)散是依賴于鼻黏膜兩側(cè)濃度梯度的被動(dòng)擴(kuò)散，其推動(dòng)力是膜兩側(cè)的濃度梯度。根據(jù)累計(jì)擴(kuò)散速率，羊鼻黏膜透析較牛鼻黏膜透析的效果好。

2.4.4 透析袋法［9］總黃酮中槲皮素、山柰素、異鼠李素的相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000D，因而選擇1 000D的透析袋。取銀杏葉提取物鼻用原位凝膠2 mL，加甲醇鹽酸稀釋液 ［甲醇-HCl(4∶1)25 mL稀釋至100 mL］4 mL溶解搖勻，精密吸取1 mL置透析袋中，袋兩頭用線扎緊，將其浸泡在70 mL甲醇鹽酸稀釋液中，置于水浴恒溫振蕩器中，溫度控制在 (37±0.5)℃，每隔一定時(shí)間點(diǎn)取樣2 mL，然后補(bǔ)加相同體積的釋放介質(zhì)。取20μL進(jìn)樣供HPLC分析，測(cè)定總黃酮的量，根據(jù)公式計(jì)算累積擴(kuò)散釋藥量，并計(jì)算累積釋藥百分率(Q)。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果求平均值，RSD為1.24%。見(jiàn)圖5。

圖5 透析袋法累積釋放百分率－時(shí)間曲線Fig.5 Time-the percentage of cumulative release curve of the bag filte

由圖5可知，銀杏葉提取物鼻用原位凝膠在6 h時(shí)釋藥量大于80%，同時(shí)表明銀杏葉鼻用原位凝膠具有一定的緩釋特征。數(shù)據(jù)分別用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程和一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程等數(shù)學(xué)模型擬合，以一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合度最佳，相關(guān)系數(shù)r為0.997 6，銀杏葉鼻用原位凝膠釋放符合一級(jí)釋藥方程。

3 討論

泊洛沙姆由于其毒性低、刺激性小、生物相容性良好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是一種理想的藥物控釋載體材料［7］。但單獨(dú)使用泊洛沙姆407作為基質(zhì)時(shí)成凝膠溫度較低，在泊洛沙姆407中加入不同量的泊洛沙姆188，可調(diào)節(jié)成凝膠溫度。殼聚糖可增加黏膜通透性，從而促進(jìn)藥物通過(guò)黏膜的吸收。本實(shí)驗(yàn)還加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)殼聚糖溶液 (0.2%、0.4%、0.6%)來(lái)考察凝膠的黏度，試驗(yàn)結(jié)果證明0.2%殼聚糖黏度較小，0.6%殼聚糖凝膠黏度過(guò)大，流動(dòng)性差，0.4%殼聚糖為最佳;研究證實(shí)，凝膠是通過(guò)藥物擴(kuò)散作用進(jìn)入體內(nèi)而不是通過(guò)凝膠溶蝕使藥物釋放;通過(guò)藥物累積釋藥百分率可以得出本凝膠劑具有一定的緩釋作用;使用透析法時(shí)藥物溶解性很重要，對(duì)于難溶的藥物應(yīng)該考慮加入增溶劑，本實(shí)驗(yàn)透析袋法曾使用鹽水作釋放介質(zhì)，結(jié)果透析袋效果不好，改用甲醇鹽酸稀釋液，取得良好效果。

本實(shí)驗(yàn)利用無(wú)膜透析試驗(yàn)考察銀杏葉提取物鼻用原位凝膠的溶蝕情況;生物膜 (牛、羊鼻黏膜)透析試驗(yàn)是模擬人鼻黏膜對(duì)藥物的透析情況，并得到藥物是通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入體內(nèi)而不是通過(guò)凝膠溶蝕使藥物釋放的結(jié)論;透析袋透析試驗(yàn)是考察藥物的相對(duì)分子質(zhì)量 (大小)對(duì)進(jìn)入人體的影響。

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