簡(jiǎn)龍海， 聞宏亮， 毛秀紅， 夏 晶， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203)

痰熱清注射液具清熱、化痰、解毒之功效，處方由黃芩、熊膽粉等五味藥材組成。其中熊膽粉為熊科動(dòng)物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁而得的干燥品［1］，主要成分為膽汁酸，并主要以?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸等結(jié)合型形式存在［2-3］。在制法中，熊膽粉先經(jīng)過(guò)水解、提取等步驟，制得中間體熊膽粉提取物后再制備注射液。理論上，痰熱清注射液中的膽汁酸應(yīng)以游離型膽汁酸為主。游離型膽汁酸有的活性強(qiáng)、毒性小，如熊去氧膽酸［4］，有的活性與毒性并存，如鵝去氧膽酸［5］，因此需要嚴(yán)格控制膽汁酸的量。目前痰熱清注射液中膽汁酸的測(cè)定集中在熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸上［6-7］，未見(jiàn)其余膽汁酸的測(cè)定報(bào)道。

關(guān)于熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的測(cè)定方法，有HPLC-ELSD 法［6-8］、HPLC-UV 法［9-10］、GC 法［11］、TLC法［12］、近紅外漫反射光譜法［13］等。GC 法需要先衍生反應(yīng)后再分析。痰熱清注射液成分復(fù)雜，TLC法和近紅外漫反射光譜法均不能滿足測(cè)定要求。HPLC-ELSD法雖可測(cè)定熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸［6-7］，但由于熊去氧膽酸的含有量較高，其余膽汁酸的含有量較低，若同時(shí)測(cè)定指紋圖譜，熊去氧膽酸的信號(hào)過(guò)強(qiáng)，呈平頭峰形，故定量測(cè)定與指紋圖譜在HPLC-ELSD上難以同時(shí)兼顧。HPLC-UV法在一定條件下可用于熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的定量測(cè)定［9］及熊膽粉的指紋圖譜分析［10］，但尚未應(yīng)用于痰熱清注射液的測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定痰熱清注射液中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸，并在此基礎(chǔ)上，測(cè)定痰熱清注射液中熊膽粉部分所有主要膽汁酸的指紋圖譜，方法簡(jiǎn)便、可行，可為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent公司);Waters 1525型高效液相色譜儀 (美國(guó)Waters公司);BP211D電子天平 (德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 試藥 熊去氧膽酸 (中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)0755-9003);鵝去氧膽酸 (中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110806-200303);乙腈、甲醇 (均為色譜純，德國(guó)Merck公司);水為純凈水;其余試劑均為分析純 ［中國(guó)醫(yī)藥 (集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司］。痰熱清注射液及熊膽粉提取物由上海凱寶藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取熊去氧膽酸對(duì)照品和鵝去氧膽酸對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并制成每1 mL中含熊去氧膽酸5.0 mg、鵝去氧膽酸0.8 mg的混合溶液，搖勻，即得。

2.2 痰熱清注射液供試品溶液的制備 取痰熱清注射液作為供試品溶液A。

2.3 熊膽粉提取物供試品溶液的制備 取熊膽粉0.15 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇振搖使溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液B。

2.4 空白溶液 (缺熊膽粉)的制備 取空白樣品(缺熊膽粉)，按痰熱清注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的處方量和制法項(xiàng)下要求制成空白溶液。

2.5 色譜條件 Waters Atlantis C18(4.6 mm×15cm，5μm)色譜柱;乙腈為流動(dòng)相A相，0.1%磷酸為B相，梯度洗脫程序見(jiàn)表1;柱溫30℃;體積流量為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm;進(jìn)樣20μL。對(duì)照品、空白 (缺熊膽粉)及供試品色譜圖見(jiàn)圖1～4。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

圖1 對(duì)照品圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances

圖2 空白樣品 (缺熊膽粉)Fig.2 HPLC chromatogram of sample w ithout bear bile powder

2.6 指紋圖譜

2.6.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.6.1.1 相似度計(jì)算中共有峰的確立 根據(jù)痰熱

圖3 痰熱清注射液樣品Fig.3 HPLC chrom atogram of Tanreqing Injection sam ple

圖4 熊膽粉提取物Fig.4 HPLC chromatogram of bear bile powder sam ple

清注射液成品、中間體熊膽粉提取物及空白溶液(缺熊膽粉)的測(cè)定結(jié)果，痰熱清注射液成品中與熊膽粉有關(guān)的共有峰主要有4個(gè) (見(jiàn)圖1～4)，其中峰1(熊去氧膽酸)面積在4個(gè)峰總面積中的比例較高 (約為75% ～80%)，對(duì)相似度計(jì)算結(jié)果的影響過(guò)大，故在相似度計(jì)算中對(duì)峰1進(jìn)行屏蔽。

2.6.1.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液A，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果峰1～峰4的峰面積RSD分別為1.3%、4.8%、2.0%、5.9%。以熊去氧膽酸為參照物，計(jì)算峰2～峰4的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.2%，相對(duì)峰面積RSD≤5.4%。以中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算相似度，結(jié)果相似度≥0.99，表明儀器精密度良好。

2.6.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液A，一式6份，依法測(cè)定，同2.6.2方法計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積和相似度，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.2%，相對(duì)峰面積RSD≤4.7%，相似度≥0.99，

表明方法重復(fù)性良好。

2.6.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液A，分別在室溫放置0、6、12、18、24 h后測(cè)定，結(jié)果峰1～峰4的峰面積RSD分別為0.5%、3.5%、0.5%、3.0%。同2.6.1.2項(xiàng)方法計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積和相似度，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間均RSD≤0.2%，相對(duì)峰面積均 RSD≤3.8%，相似度≥0.99，表明供試品溶液A在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.2 痰熱清注射液中熊膽粉部分對(duì)照指紋圖譜的建立及13批成品的測(cè)定 取13批成品進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)相似度軟件獲得對(duì)照指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖5、表 2。13批成品的相似度分別為 0.998、0.997、 0.999、 0.989、 0.999、 0.998、 0.999、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999、0.989。

圖5 痰熱清注射液熊膽粉部分13批次樣品HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of 13 batches of Tanreqing Injection sample

表2 指紋圖譜中共有峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積Tab.2 Relative retention time and relative peak area of co-possessing peaks and their RSDs

2.7 樣品測(cè)定

2.7.1 線性關(guān)系考察 分別取熊去氧膽酸對(duì)照品和鵝去氧膽酸對(duì)照品適量，精密稱定，分別用甲醇溶解并制成每1 mL中含熊去氧膽酸 13.064 mg、17.14 mg的對(duì)照品溶液和每1 mL中含鵝去氧膽酸5.21 mg的對(duì)照品溶液。分別精密吸取質(zhì)量濃度為13.064 mg/mL的熊去氧膽酸對(duì)照品溶液0.5、1、2、5、10、20μL，質(zhì)量濃度為17.14 mg/mL的熊去氧膽酸對(duì)照品溶液40μL，質(zhì)量濃度為5.21 mg/mL的鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液0.5、1、2、5、10、40μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得熊去氧膽酸回歸方程Y=8.688X+8.141(r=0.999 9)，鵝去氧膽酸回歸方程 Y=8.213X+1.139(r=0.999 9)。結(jié)果表明:熊去氧膽酸進(jìn)樣量在6.532μg～685.6μg范圍內(nèi)、鵝去氧膽酸進(jìn)樣量在2.605μg～208.4μg范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.7.2 精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別同2.6.1.2、2.6.1.4。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液A 6份，測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸RSD分別為1.1%、1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 回收率試驗(yàn) 取供試品溶液A 9份，每份0.8 mL(分別含熊去氧膽酸4.896 mg、鵝去氧膽酸0.672 mg)，分別置2 mL量瓶中，各精密加入熊去氧膽酸對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為13.064 mg/mL)0.3、0.4、0.5 mL和鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為5.21 mg/mL)0.1、0.2、0.3 mL，加甲醇至刻度，搖勻，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及其RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.3 Results of recovery tests(n=9)

2.7.5 樣品測(cè)定 取13批痰熱清注射液成品，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 痰熱清注射液樣品中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of ursodesoxycholic acid and chenodeoxycholic acid in Tanreqing Injection

3 討論

3.1 指紋圖譜中各峰的確認(rèn) 將流動(dòng)相中磷酸改為甲酸，其余不變，采用LC-DAD-MSn聯(lián)用儀，對(duì)4個(gè)共有峰進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果峰1、峰3分別為熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸，峰2、峰4均為膽汁酸，具體結(jié)構(gòu)式將進(jìn)一步研究。

3.2 色譜柱的考察 分別取3種色譜柱 ［Waters Atlantis dC18色譜柱 (5μm，4.6 mm×15 cm);Dikma Kromasil C18色譜柱 (5μm，4.6 mm×15 cm);Dikma Kromasil C18色譜柱 (5μm，4.6 mm×25 cm)］進(jìn)行分析，結(jié)果均無(wú)干擾。

3.3 柱溫和體積流量的考察 分別在柱溫25、30、40℃和體積流量為0.8、1.0、1.2 mL/min時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果柱溫和體積流量的變化對(duì)分離度、峰形均無(wú)明顯影響;柱溫的變化對(duì)峰面積和保留時(shí)間的影響不大;體積流量對(duì)峰面積的影響較大，體積流量越大，峰面積越小，但對(duì)指紋圖譜、定量測(cè)定結(jié)果均無(wú)明顯影響。

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