余繼英，何 林，傅 川，董 蕓，陳 璐，李晉奇，師健友

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，a.藥劑科，b.急診內(nèi)科，四川 成都 610072;2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

氫氯噻嗪屬噻嗪類利尿劑，除利尿作用外，在高血壓治療中也具有重要作用［1］，其降壓機(jī)制除減少血容量之外，還可降低外周血管阻力，是抗高血壓復(fù)方制劑中常用的組分［2］，如血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)+噻嗪類利尿劑，是各國高血壓指南推薦的聯(lián)合降壓方案之一［3］。相關(guān)研究也表明ARB+氫氯噻嗪對老年單純收縮期高血壓具有較好的療效［4］。對生物樣本中氫氯噻嗪的測定，文獻(xiàn)報(bào)道的有 HPLC-UV 法［5，6］及 HPLC-MS-MS 法［7～9］。本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)，利用現(xiàn)有條件，所建立的測定血漿氫氯噻嗪的LC-MS法靈敏準(zhǔn)確，可用于人血漿中氫氯噻嗪濃度的測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters 2695高效液相色譜儀;Waters ZQ質(zhì)譜儀，Waters MassLynx V4.1色譜工作站(美國Waters公司);沙多利斯BP211型電子天平(德國沙多利斯);DIKA?Genius 3漩渦混合器(德國);HC-2517高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);320R型低溫離心機(jī)(德國)。氫氯噻嗪對照品，批號:100309-200702，含量99.8%，中國藥品生物制品檢定所;對乙酰氨基酚對照品(內(nèi)標(biāo))，批號:100018-200408，中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為純凈水。

1.2 方法

1.2.1 色譜、質(zhì)譜條件 ①色譜條件:色譜柱選用XTerra? MSC18柱(5 μm，2.1 mm×150 mm);保護(hù)柱:Diamonsil C18(2)Gartridges(3 μm，2.1 mm×10 mm)，柱溫30℃。流動(dòng)相:水:乙腈－60:40;流速:0.2 ml/min。進(jìn)樣量:5μl。②質(zhì)譜條件:電噴霧電離源(ESI－);選擇離子監(jiān)測(SRM;氫氯噻嗪 m/z 296，錐孔電壓35 V;對乙酰氨基酚 m/z 150，錐孔電壓30 V);毛細(xì)管電壓2.5 kV;錐孔電壓40 V;二級錐孔電壓4 V;六級桿透鏡電壓0.4 V;源溫度120℃;脫溶劑氣溫度350℃;脫溶劑氣流量650 L/H。

1.2.2 溶液配制 精密稱取氫氯噻嗪對照品10.52 mg于10 ml容量瓶，用50%甲醇溶解并定容，得氫氯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1(1.05 mg/ml)，－4℃冷藏保存，臨用前用50%甲醇稀釋為系列濃度工作液。精密稱取對乙酰氨基酚10.61 mg于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻即得濃度為1.06 mg/ml的對乙酰氨基酚內(nèi)標(biāo)儲備液，4℃冷藏保存，臨用前用50%甲醇稀釋為1μg/ml的溶液，即得對乙酰氨基酚內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.3 樣品預(yù)處理與測定 取血漿樣品0.5 ml，加50%乙腈50μl，再加入25μl內(nèi)標(biāo)工作液(對乙酰氨基酚，1μg/ml)，漩渦混勻后，加乙酸乙酯3 ml，漩渦混合2分鐘，于低溫離心機(jī)(3000轉(zhuǎn)/分，6℃)離心8分鐘，取上清液于干燥玻璃管中，50℃水浴氮?dú)鈸]干，殘?jiān)屑尤?0%乙腈120μl溶解后，分裝入全自動(dòng)進(jìn)樣器，進(jìn)樣5μl，在設(shè)定的色譜和質(zhì)譜條件下測定。記錄氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積，以氫氯噻嗪峰面積和內(nèi)標(biāo)的峰面積之比代入當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出樣品氫氯噻嗪的濃度。

1.2.4 方法學(xué)考察 ①專屬性:在選定的色譜和質(zhì)譜條件下，取氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)對照品溶液、空白血漿及空白血漿加氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)樣品經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)樣分析，考察方法的專屬性。②標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限:取空白血漿0.5 ml共9份，分別加入50μl氫氯噻嗪系列濃度溶液，使血漿氫氯噻嗪為0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 和 150 μg/L，按“1.2.3”項(xiàng)下，自“再加入25μl內(nèi)標(biāo)工作液(對乙酰氨基酚，1μg/ml)”起操作。同法制備并測定空白樣品。記錄氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積，以氫氯噻嗪峰面積和內(nèi)標(biāo)的峰面積之比對應(yīng)其濃度進(jìn)行線性回歸，得出氫氯噻嗪血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。③方法精密度與準(zhǔn)確度:取空白血漿0.5 ml，配制含氫氯噻嗪三種濃度分別為1，10 和 100 μg/L 的質(zhì)控樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下，自“再加入25μl內(nèi)標(biāo)工作液”起操作，以藥物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比在當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出氫氯噻嗪濃度，每一濃度于同日內(nèi)進(jìn)行5樣本制備與分析，計(jì)算其準(zhǔn)確度及批內(nèi)RSD。于不同日連續(xù)測定3批，計(jì)算其批間RSD。④提取回收率:取離心管3支，分別加入濃度為10、100和1000μg/L的氫氯噻嗪工作液各50μl，各管再加入25μl內(nèi)標(biāo)工作液(對乙酰氨基酚，1μg/ml)，50℃水浴氮?dú)鈸]干，殘?jiān)?0%乙腈120μl溶解后進(jìn)樣，記錄色譜圖，所得峰面積記為A1;取空白血漿，配制含氫氯噻嗪三種濃度分別為1，10和100μg/L的質(zhì)控樣品，每種濃度各配制3個(gè)樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下，自“再加入25 μl內(nèi)標(biāo)工作液”起操作，進(jìn)樣并記錄色譜圖，所得峰面積記為A2。以A2/A1×100計(jì)算氫氯噻嗪及內(nèi)標(biāo)對乙酰氨基酚提取回收率。⑤基質(zhì)效應(yīng):取離心管3支，分別加入濃度為10，100和1000μg/L的氫氯噻嗪工作液各50μl，各管再加入25μl內(nèi)標(biāo)工作液(對乙酰氨基酚，1μg/ml)，50℃水浴氮?dú)鈸]干，殘?jiān)?0%乙腈120μl溶解后進(jìn)樣，記錄色譜圖，所得峰面積記為A1。取空白血漿樣品0.5 ml，加入50%乙腈75μl，乙酸乙酯3 ml，漩渦混合2分鐘，于低溫離心機(jī)(3000轉(zhuǎn)/分，6℃)離心8分鐘，取上清液于干燥玻璃管中，50℃水浴氮?dú)鈸]干，殘?jiān)?0%乙腈120μl溶解后混勻。同法制備20份，合并作為空白基質(zhì)溶液備用。取離心管，分別加入濃度為10、100和1000μg/L的氫氯噻嗪工作液各50μl(每種濃度各5份)，各管再加入25μl內(nèi)標(biāo)工作液(對乙酰氨基酚，1μg/m l)，50℃水浴氮?dú)鈸]干后，分別加入空白基質(zhì)溶液各120μl，混勻后進(jìn)樣并記錄其色譜峰面積A2;以A2/A1×100計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。⑥血樣穩(wěn)定性:分別取在室溫放置4和8 h后、－20℃冷凍后凍融1，2，3 次、－20 ℃保存14、24 和48 天的含氫氯噻嗪三種濃度分別為1，10和100μg/L的血漿樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下操作，由當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算氫氯噻嗪濃度，每一濃度測定3份樣品。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察 ①專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限:由圖1～圖3可見，氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為2.4 min和2.1 min，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)基本不影響樣品的分離測定;氫氯噻嗪血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程證明氫氯噻嗪血藥濃度在0.5～150μg/L范圍內(nèi)與峰面積比之間有良好線性關(guān)系。氫氯噻嗪的最低定量限為0.5μg/L。②方法精密度與準(zhǔn)確度:見表1。③氫氯噻嗪及內(nèi)標(biāo)對乙酰氨基酚提取回收率分別為57.0% ～72.8%及(56.3±3.3)%。④基質(zhì)效應(yīng):氫氯噻嗪在1、10和100μg/L三種血漿濃度水平的基質(zhì)效應(yīng)平均值分別為(93.5±8.1)%、(93.8±6.1)%和(94.5±6.0)%;內(nèi)標(biāo)對乙酰氨基酚的基質(zhì)效應(yīng)值為(74.6±8.75)%。氫氯噻嗪及內(nèi)標(biāo)對乙酰氨基酚的基質(zhì)效應(yīng)均可滿足測定要求。⑤血樣穩(wěn)定性:氫氯噻嗪血漿樣品在室溫放置8h、經(jīng)－20℃反復(fù)凍融3次、在－20℃保存48天，氫氯噻嗪濃度無明顯變化。含氫氯噻嗪血漿樣品經(jīng)處理后室溫放置24 h，氫氯噻嗪濃度無明顯變化;氫氯噻嗪儲備液于4℃下保存65天仍然穩(wěn)定，對乙酰氨基酚儲備液于4℃下保存47天仍然穩(wěn)定，均能滿足生物樣品測定要求。

2.2 方法應(yīng)用 本方法應(yīng)用于氯沙坦鉀氫氯噻嗪片生物等效性試驗(yàn)。試驗(yàn)方案經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)，志愿者在知情情況下填寫知情同意書。按照試驗(yàn)方案選擇21名健康男性受試者參加試驗(yàn)。試驗(yàn)當(dāng)日晨給藥前在前臂靜脈安置留置針(可保留至給藥后12小時(shí))，抽取空白血樣4 ml后，分別空腹用200 ml溫水送服氯沙坦鉀氫氯噻嗪試驗(yàn)制劑和參比制劑62.5mg，并于服藥后0.33、0.67、1、1.33、1.67、2、2.5、3、4、6、8、10、12、24、36 和 48 h 各采靜脈血4 ml置于含肝素的試管中，抽取的血樣于2500 rpm離心，分離血漿，置 －20℃的低溫冰箱保存?zhèn)錅y。21例受試者交叉口服試驗(yàn)制劑和參比制劑后均值血藥濃度－時(shí)間曲線見圖4。

圖1 氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)對乙酰氨基酚對照品的總離子色譜圖(A)、選擇離子色譜圖B(m/z296)和C(m/z150)1氫氯噻嗪;2對乙酰氨基酚

圖2 空白血漿的總離子色譜圖(A)、選擇離子色譜圖B(m/z296)和C(m/z150)

圖3 空白血漿加氫氯噻嗪和內(nèi)標(biāo)對乙酰氨基酚的總離子色譜圖(A)、選擇離子色譜圖B(m/z296)和C(m/z150)1氫氯噻嗪;2對乙酰氨基酚

表1 精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=15)

圖4 21例健康受試者口服62.5 mg氯沙坦鉀氫氯噻嗪片試驗(yàn)制劑與參比制劑后氫氯噻嗪的均值藥時(shí)曲線

3 討論

氫氯噻嗪的水溶性較強(qiáng)，但僅以甲醇、乙腈進(jìn)行去蛋白處理后進(jìn)樣分析，內(nèi)源性雜質(zhì)干擾較大，因此考慮用液-液萃取法對血樣進(jìn)行預(yù)處理。在對比了乙醚、甲基叔丁基醚、醋酸乙酯及二氯甲烷的提取效果后，發(fā)現(xiàn)醋酸乙酯提取效率較高，內(nèi)源性雜質(zhì)基本不干擾測定，因此選擇醋酸乙酯為提取溶劑。

氫氯噻嗪在ES-模式下才可電離，在流動(dòng)相的選擇方面，考慮通過在流動(dòng)相中加入乙酸銨以得到更高的靈敏度，實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，與不加乙酸銨相比，加入乙酸銨后在測定物峰形、靈敏度方面并無明顯改善，因此最終選擇流動(dòng)相為水:乙腈-60:40。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，能滿足生物樣品測定的要求。

21名健康受試者口服單劑量氯沙坦鉀氫氯噻嗪片試驗(yàn)制劑和參比制劑后，氫氯噻嗪主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無顯著性差異，體內(nèi)過程與文獻(xiàn)［10］報(bào)道基本吻合。

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