基于類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（TALEs）的基因組定點(diǎn)操控技術(shù)

趙美威，段承俐，劉 江

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201

2. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 中國(guó)科學(xué)院和云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223

—鋅指蛋白（zinc finger proteins, ZFPs）DNA結(jié)合域及限制性內(nèi)切酶 FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域所組成的能夠?qū)蚪M進(jìn)行定點(diǎn)編輯的融合蛋白（Bibikova et al, 2001; Kim et al, 1996）。ZFP DNA結(jié)合域能夠使ZFN結(jié)合特定DNA序列，并于基因組的特定位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂（double-strand break, DSB），隨后，通過細(xì)胞本身對(duì)雙鏈斷裂的修復(fù)來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)編輯。經(jīng)過～15年的發(fā)展，ZFN技術(shù)已經(jīng)被成功應(yīng)用于體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞及多種模式生物，甚至一期臨床試驗(yàn)研究（Urnov et al, 2010）。然而，其固有的局限性也在很大程度上阻礙了 ZFN技術(shù)的更廣泛發(fā)展（DeFrancesco, 2011），例如，（1）由于ZFP的氨基酸序列和它所識(shí)別的DNA序列之間并非一一對(duì)應(yīng)，且在自然界中無法找到能夠識(shí)別三個(gè)連續(xù)核苷酸的鋅指結(jié)構(gòu)域，故ZFNs靶位點(diǎn)的選擇受到了很大限制；（2）由于 ZFN技術(shù)專利被Sangamo BioSciences 公司所壟斷，且ZFNs的設(shè)計(jì)與合成技術(shù)難度很大，因此，對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室而言，該技術(shù)成本過高，不適于廣泛應(yīng)用；（3）可能由于在基因組的很多位點(diǎn)存在脫靶現(xiàn)象，故ZFN技術(shù)的細(xì)胞毒性很強(qiáng)（Carroll, 2008; Mani et al, 2005）。

近年來，基于類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（transcription activator-like effectors，TALEs）的基因組操控技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用有望彌補(bǔ) ZFN技術(shù)的局限性。TALEs是來源于植物病原體——黃單胞桿菌（Xanthomonas spp.）的DNA結(jié)合蛋白，被注入植物宿主后，可與宿主特定基因的啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄，并最終影響植物發(fā)病過程。2007年，首次報(bào)道了TALEs具有結(jié)合DNA 的特性（Romer et al, 2007）。兩年以后，兩個(gè)獨(dú)立研究組分別破譯了 TALEs識(shí)別 DNA序列的編碼法則（Boch et al, 2009; Moscou & Bogdanove, 2009）。TALEs理論上可以識(shí)別任何DNA序列，盡管該技術(shù)開發(fā)的時(shí)間相對(duì)較晚，但是，已經(jīng)在酵母、植物、斑馬魚、大鼠和多種體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞中得到了成功應(yīng)用（Sanjana et al, 2012）。研究者已經(jīng)運(yùn)用該技術(shù)成功上調(diào)了目的基因轉(zhuǎn)錄（Geissler et al, 2011;Miller et al, 2011; Morbitzer et al, 2010; Sanjana et al,2012; Zhang et al, 2011）以及對(duì)基因組編輯（Bogdanove & Voytas, 2011; DeFrancesco, 2011;Scholze & Boch, 2011; Tesson et al, 2011）。目前看來，TALEs技術(shù)可以和 ZFNs技術(shù)一樣用于多物種的基因組定點(diǎn)操控，并且在某些方面具有一定優(yōu)勢(shì)。

本文綜述了近年來TALEs技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，分類討論了運(yùn)用 TALEs對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因組編輯（包括基因敲除和基因插入）的策略，并對(duì)該技術(shù)在基因組操控應(yīng)用中的特異性及其相對(duì)于ZFNs技術(shù)的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了探討。

1 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（TALEs）

TALEs是由多種黃單胞桿菌所分泌的天然細(xì)菌效應(yīng)物蛋白，主要通過調(diào)控宿主植物的基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)黃單胞桿菌在植物體內(nèi)的繁殖和擴(kuò)散。天然 TALEs 主要由位于 N端的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)（translocation signal）、位于 C端的核定位信號(hào)（nuclear localization signals, NLS）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcriptional activation domain, AD）以及位于中間的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域三部分組成（iii）（Boch &Bonas, 2010; Bogdanove et al, 2010）。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由包含33～35（通常為34）個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)單元串聯(lián)而成，介導(dǎo)DNA特異識(shí)別與結(jié)合（圖1A）。天然TALEs所包含的重復(fù)單元數(shù)為1.5～33.5（Boch & Bonas, 2010）。每個(gè)重復(fù)單元序列高度保守，主要區(qū)別在于第12和第13位的重復(fù)可變雙殘基（repeat variant di-residue, RVD）。研究發(fā)現(xiàn)每個(gè)重復(fù)單元的 RVD決定了其所識(shí)別的核苷酸，且其識(shí)別遵循一個(gè)簡(jiǎn)單法則：NI=A, HD=C, NG=T,NN=G or A（圖 1a）（Boch et al, 2009; Moscou &Bogdanove, 2009）。另外，最近的研究表明NH作為一種RVD 也能夠高效識(shí)別G，且特異性高于NN（Streubel et al, 2012）。對(duì)TALE蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，每個(gè)TALE重復(fù)單元由一個(gè)短α螺旋和一個(gè)長(zhǎng)α螺旋通過一個(gè)包含RVD的環(huán)相連形成，第12位的氨基酸殘基主要起穩(wěn)定RVD環(huán)的作用，而第13位的氨基酸殘基決定TALE蛋白所識(shí)別的核苷酸，所有的重復(fù)單元相互連接在一起形成可以鑲嵌在TALE蛋白所識(shí)別的DNA的大溝中的右手超螺旋結(jié)構(gòu)（Deng et al, 2012a; Mak et al, 2012）。TALE蛋白識(shí)別核苷酸的簡(jiǎn)單法則和其晶體結(jié)構(gòu)解釋了TALEs識(shí)別DNA的特異性，且由于每個(gè)重復(fù)單元與其所識(shí)別核苷酸一一對(duì)應(yīng)，因此，理論上可以人為設(shè)計(jì)能夠識(shí)別并結(jié)合任何DNA序列的TALEs蛋白。研究還發(fā)現(xiàn)RVD為NG的重復(fù)單元可以特異識(shí)別并結(jié)合5-甲基胞嘧啶（mC），即TALEs蛋白還可以識(shí)別甲基化的核苷酸（Deng et al, 2012b）。目前尚不明確為什么自然界中發(fā)現(xiàn)的 TALEs在植物基因組中所識(shí)別的5′端第一個(gè)堿基總是T（Boch et al, 2009; Moscou & Bogdanove, 2009），以及為什么串聯(lián)重復(fù)的DNA結(jié)合域總是以半個(gè)重復(fù)單元結(jié)束，但是，它們對(duì)于TALEs的活性均至關(guān)重要（圖1a）。因此，TALEs所識(shí)別的DNA序列的長(zhǎng)度=完整重復(fù)單元數(shù)+2。如圖1B中的TALE共包含17個(gè)完整重復(fù)單元，但其所識(shí)別的堿基序列應(yīng)為“TGGAAGACCGCCAGGGGGT”，共 19個(gè)堿基?？傊?，TALE蛋白識(shí)別核苷酸簡(jiǎn)單法則的破譯以及其晶體結(jié)構(gòu)的解析已經(jīng)為 TALEs在基因組定點(diǎn)操控中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

圖1 TALE蛋白結(jié)構(gòu)及其基因組操控模型Figure 1 Structure and genome engineering model of TALE proteins

TALEs技術(shù)要想成功應(yīng)用，靶位點(diǎn)選擇至關(guān)重要。從目前的研究結(jié)果來看，人工設(shè)計(jì)的 TALEs所識(shí)別的5′端第一個(gè)堿基必須為T （Bogdanove &Voytas, 2011；Reyon et al, 2012）。此外，為了便于利用TALEs開展研究工作，許多實(shí)驗(yàn)室還建立了公開網(wǎng)站幫助研究人員預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì) TALEs 靶位點(diǎn)。例如：Bogdanove 和 Voytas 實(shí)驗(yàn)室建立的TALE-NT 網(wǎng)站（https://tale-nt.cac.cornell.edu/）、Joung 實(shí)驗(yàn)室建立的 ZiFiT 網(wǎng)站（http://zifit.partners.org/ZiFiT/）和 Zhu實(shí)驗(yàn)室建立的 idTALE網(wǎng)站（http://idtale.kaust.edu.sa/）等。

TALEs靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)完成后，如何合成能夠識(shí)別靶位點(diǎn)的TALEs蛋白就成為TALE技術(shù)中關(guān)鍵步驟和應(yīng)用瓶頸。雖然，目前已有多種方法可解決該問題，多個(gè)生物技術(shù)公司（包括國(guó)內(nèi)的公司）也已可提供TALEs合成服務(wù)，但是，對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來說，要想自己合成具有高活性的 TALEs仍較有難度，因此，本文不深入探討人工構(gòu)建TALEs。

2 基于TALEs的靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控

TALE蛋白模塊化的結(jié)構(gòu)非常有利于人為設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄。天然TALEs的主要功能是激活宿主易感基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)病原體在宿主體內(nèi)的繁殖和擴(kuò)散（Boch & Bonas, 2010;Bogdanove et al, 2010）。植物病原體黃單胞桿菌通過III型類注射器分泌系統(tǒng)將TALEs注入宿主細(xì)胞，然后TALEs被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，并通過DNA結(jié)合域與目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列結(jié)合來激活目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄。因此，可通過人為融合TALEs與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）或者轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域（RD）來調(diào)控內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄（Bogdanove & Voytas, 2011）。

通過融合人為設(shè)計(jì)的 TALEs與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、來源于單純皰疹病毒的VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（圖1b）或者VP16四聚體衍生物VP64，已有多個(gè)研究組成功實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)錄的靶向激活（Geissler et al, 2011; Miller et al, 2011; Morbitzer et al, 2010; Sanjana et al, 2012; Zhang et al, 2011）。通過與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列特異性結(jié)合，TALE-ADs可通過特異性招募轉(zhuǎn)錄復(fù)合體來起始基因轉(zhuǎn)錄。這些人工合成的TALE-ADs可在植物中（Geissler et al,2011; Morbitzer et al, 2010）及體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞中起作用（Geissler et al, 2011; Miller et al, 2011;Sanjana et al, 2012; Zhang et al, 2011），通常可以使目的基因表達(dá)增加 20倍以上。在相同條件下，人為設(shè)計(jì)并合成的特異性TALE-ADs與ZF-VP64具有相似甚至更好的作用效果（Zhang et al, 2011）。另外，在植物中，使用內(nèi)源轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域效果優(yōu)于VP16，但是，在體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞中，情況卻正好相反（Geissler et al, 2011）。同樣，通過融合人為設(shè)計(jì)的TALE與轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域即可特異性抑制基因轉(zhuǎn)錄（Bogdanove & Voytas, 2011）。

雖然，大多數(shù)人工合成的TALE-ADs具有很強(qiáng)的激活轉(zhuǎn)錄能力，但效果卻相去甚遠(yuǎn)，即可能存在其它影響TALEs與DNA結(jié)合的因素（Zhang et al,2011），例如，每種RVD與DNA結(jié)合強(qiáng)弱的差別、TALEs結(jié)合位點(diǎn)在基因組中的不同位置以及哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)錄過程的復(fù)雜性等（Boch et al, 2009;Miller et al, 2011; Scholze & Boch, 2010）。但是，這些因素的具體影響尚不明確。另外，由于人工合成的TALE- ADs以單體形式作用，故可以預(yù)期其作用特異性低于以二聚體形式作用的 TALENs（見下文）。事實(shí)上，首例在擬南芥中將合成 TALE-ADs用于激活目的基因的研究中，共合成了兩個(gè)TALE-ADs，并預(yù)測(cè)了其在擬南芥基因組的四個(gè)可能脫靶位點(diǎn)，每個(gè)脫靶位點(diǎn)均具兩個(gè)堿基錯(cuò)配，而實(shí)驗(yàn)證明，僅其中一個(gè)脫靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄被激活（Morbitzer et al, 2010）。通過改變合成TALEs所識(shí)別的核苷酸的序列來研究錯(cuò)配位點(diǎn)的位置和數(shù)目對(duì)TALE活性的影響，Zhang et al（2011）的研究顯示錯(cuò)配位點(diǎn)數(shù)目與TALE活性成反比。該結(jié)論與前人觀察一致，即不同錯(cuò)配數(shù)目，或不同錯(cuò)配位置，對(duì)TALE活性的影響也不同，即使是單個(gè)位點(diǎn)的錯(cuò)配有時(shí)候也會(huì)使TALE完全失去活性（Bogdanove et al, 2010）。然而，TALE識(shí)別DNA的特異性最有可能是由結(jié)合位點(diǎn)的位置、染色質(zhì)狀態(tài)及錯(cuò)配數(shù)目共同作用決定（Boch et al, 2009; Bogdanove & Voytas,2011; Kay et al, 2009; Romer et al, 2009; Scholze &Boch, 2010; Zhang et al, 2011）。因此，需要對(duì)錯(cuò)配數(shù)目范圍、適合的結(jié)合位點(diǎn)位置以及染色質(zhì)狀態(tài)等對(duì)TALEs特異性的影響進(jìn)行深入研究。

3 基于TALENs的基因組靶向編輯

在模式生物中，靶向編輯基因組可有效促進(jìn)基因插入、敲除和矯正，其關(guān)鍵在于在目標(biāo)位點(diǎn)準(zhǔn)確引入雙鏈斷裂（DSB）。產(chǎn)生的DSB能夠通過兩個(gè)在真核細(xì)胞中高度保守的修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)，即非同源末端連接修復(fù)（non-homologous end joining,NHEJ）和同源重組修復(fù)（homologous recombination,HR）（Urnov et al, 2010）。NHEJ能夠快速有效地重新連接斷裂末端，在該過程中會(huì)于連接位點(diǎn)引入小的插入或缺失，從而造成目的基因移碼突變并失去原有功能。而HR需要一個(gè)攜帶有斷裂位點(diǎn)兩端遺傳信息的同源DNA臂來實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)矯正（少數(shù)核苷酸的改變）或定點(diǎn)插入一個(gè)新基因。這兩種高度保守的DNA損傷修復(fù)方式可被用于對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞或模式生物進(jìn)行基因組靶向編輯。要想在特定位點(diǎn)產(chǎn)生DSB就需要具高保真DNA識(shí)別和定點(diǎn)切割功能的蛋白，序列特異的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）正好具備該功能。

與ZFNs相似，TALENs亦為通過將TALE的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與FokI限制性內(nèi)切酶的非特異性核酸酶結(jié)構(gòu)域融合所產(chǎn)生的能夠被用于基因組靶向編輯的蛋白（圖1c）（Bogdanove& Voytas, 2011;Scholze & Boch, 2011）。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠使TALEN與目標(biāo)DNA序列結(jié)合，然后FokI切割目標(biāo)DNA并產(chǎn)生DSB。FokI需要形成二聚體以產(chǎn)生活性，因此，通常會(huì)設(shè)計(jì)兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)很接近的TALENs，以便FokI能夠形成二聚體并在兩個(gè)TALENs結(jié)合位點(diǎn)之間產(chǎn)生DSB，進(jìn)而誘使細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)NHEJ或者HR修復(fù)（Bogdanove & Voytas,2011; DeFrancesco, 2011; Li et al, 2011; Scholze &Boch, 2011; Wood et al, 2011; Zhang et al, 2011）。該基因組編輯方式是通過在特定基因組位點(diǎn)引入DSB并誘使細(xì)胞對(duì)產(chǎn)生的DSB進(jìn)行預(yù)期修復(fù)來實(shí)現(xiàn)的對(duì)基因組準(zhǔn)確而有效的遺傳修飾。用于引入DSB的TALENs是人工設(shè)計(jì)的序列特異核酸內(nèi)切酶，可根據(jù)需要來選擇所要切割的位點(diǎn)。下文將分類討論利用TALENs所進(jìn)行的成功基因組靶向編輯及其應(yīng)用。

3.1 基于非同源末端連接的基因敲除

目前，TALENs技術(shù)在基因組編輯中最簡(jiǎn)單、最廣泛的應(yīng)用為基因敲除。它利用NHEJ修復(fù)過程中引入的不正確插入或缺失來干擾或敲除一個(gè)基因或者一個(gè)基因組區(qū)段的功能。在過去三年里，該技術(shù)已在很多物種以及體外培養(yǎng)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)敲除。

3.1.1 在模式生物中的基因敲除

酵母是第一個(gè)成功利用TALENs技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)敲除的模式生物（Cermak et al, 2011; Christian et al, 2010; Li et al, 2011）。通過將ZFNs中的DNA識(shí)別域替換為兩個(gè)研究較為透徹的天然TALEsDNA識(shí)別域，即來源于胡椒的病原體Xanthomonas campestris pv.的AvrBs3及來源于水稻病原體X. oryzae pv. Oryzae的PthXo1，產(chǎn)生了能夠識(shí)別和切割目標(biāo)DNA的TALENs。這兩個(gè)TALENs在酵母中切割目的DNA的活性可通過LacZ的活性來檢測(cè)。結(jié)果表明它們都能夠有效切割目標(biāo)位點(diǎn)，其中PthXo1 TALEN的活性與ZFN陽性對(duì)照很接近（Christian et al, 2010）。另一項(xiàng)研究開發(fā)了一種能夠有效組裝TALEN重復(fù)序列的方法，同時(shí)，還基于自然界中發(fā)現(xiàn)的 TALEs的特性開發(fā)了可用于人工設(shè)計(jì)TALENs的軟件（Cermak et al, 2011）。研究者還針對(duì)15個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)制作了30個(gè) TALENs，并在酵母中檢測(cè)了這15對(duì)TALENs切割目的DNA的能力。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，這15對(duì)TALENs均具顯著切割目的DNA的活性，其中14對(duì)的切割活性均不低于ZFN陽性對(duì)照活性的25%。

以天然TALE Hax3為骨架針對(duì)新的目標(biāo)位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成的TALENs及其在煙草葉片中的短暫表達(dá)說明，新的TALENs可以在目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生DSB，且所產(chǎn)生的DSB緊接著就會(huì)通過NHEJ進(jìn)行修復(fù)（Mahfouz et al, 2011）。

目前TALEN技術(shù)也已被成功用于大鼠基因組的靶向敲除（Tesson et al, 2011），這正好可以與此前運(yùn)用 ZFN技術(shù)對(duì)大鼠所進(jìn)行的基因組修飾結(jié)果進(jìn)行比較（Buehr et al, 2008; Cui et al, 2011; Geurts et al, 2009; Li et al, 2008）。通過將不同劑量編碼TALENs的核酸（DNA和mRNA）注射到單細(xì)胞大鼠胚胎中來檢測(cè)其改變目的基因序列的能力。總體而言，9.5%的注射了DNA的大鼠胚胎和58%的注射了mRNA的大鼠胚胎在IgM位點(diǎn)發(fā)生突變。IgM位點(diǎn)的突變比例是于注射的TALEN劑量相關(guān)，最高為75%（注射的mRNA濃度為10 ng/μL及4 ng/μL）。另外，經(jīng)過TALEN技術(shù)產(chǎn)生的突變還可通過生殖細(xì)胞傳到下一代。與此前運(yùn)用ZFN技術(shù)對(duì)大鼠IgM基因進(jìn)行突變的結(jié)果相比（Geurts et al, 2009）, 當(dāng)以DNA注射時(shí)，TALEN技術(shù)和ZFN技術(shù)的突變比例一致（9%）。然而，當(dāng)以mRNA注射時(shí)，TALEN技術(shù)的突變比例（59%）要高于ZFN技術(shù)（19%）。另外，以TALEN技術(shù)注射的胚胎所得到的新生大鼠個(gè)體比例（25%）也高于 ZFN技術(shù)（13%）。因此，從某種程度上來說，TALEN技術(shù)對(duì)大鼠進(jìn)行基因組編輯的應(yīng)用要比ZFN技術(shù)更具優(yōu)勢(shì)（Tesson et al, 2011）。

約一半世界人口均靠水稻養(yǎng)活，但是，由水稻白葉枯菌（X. oryzae）所引起白葉枯病對(duì)水稻產(chǎn)量具有很強(qiáng)的破壞性。目前，研究人員已經(jīng)成功利用TALEN技術(shù)對(duì)白葉枯菌易感基因Os11N3進(jìn)行了修飾，使水稻對(duì)該菌具有了抗性（Li et al, 2012）。白葉枯菌能夠利用自身的 TALEs AvrXa7或者PthXo3，來激活水稻Os11N3基因表達(dá)，從而可以利用水稻細(xì)胞里的糖分來滿足白葉枯菌自身的營(yíng)養(yǎng)需求（Antony et al, 2010; Chen et al, 2012）。Os11N3基因的啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)天然TALE AvrXa7的結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)與另一個(gè)天然TALE PthXo3的結(jié)合位點(diǎn)相重疊。研究人員針對(duì)這兩個(gè)天然TALEs結(jié)合位點(diǎn)的重疊區(qū)域設(shè)計(jì)了TALENs，既可以阻止白葉枯菌的TALEs AvrXa7和PthXo3結(jié)合 Os11N3基因的啟動(dòng)子區(qū)，又不會(huì)影響Os11N3基因的正常功能，編碼 TALENs的質(zhì)?？赏ㄟ^根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）轉(zhuǎn)入到水稻胚胎細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)證明TALENs修飾的Os11N3基因不能夠再被白葉枯菌自身的TALEs AvrXa7或者PthXo3所誘導(dǎo)（Li et al, 2012）。

迄今為止，TALEN技術(shù)在斑馬魚基因組編輯中的應(yīng)用最為成功。為檢測(cè)TALENs在斑馬魚體細(xì)胞中的活性以及比較TALENs和ZFNs在基因編輯中的效率，研究人員針對(duì)斑馬魚的兩個(gè)內(nèi)源基因，gria3a和hey2，分別設(shè)計(jì)了3對(duì)和1對(duì)TALENs。結(jié)果顯示這4對(duì)TALENs都能夠在目標(biāo)位點(diǎn)有效引入突變，頻率為11%～33%。該頻率與在同樣位點(diǎn)用ZFNs所得到的頻率相差不大。但是，該研究并未證明由TALENs所引入的突變是否可遺傳（Sander et al, 2011）。另一個(gè)研究組發(fā)展了可以組裝任意數(shù)目 TALE重復(fù)單元的方法，即“分單元組裝（unit assembly）”，并證明該方法合成的TALENs可在斑馬魚基因組中有效產(chǎn)生可遺傳變異（Huang et al,2011）。一年后，TALEN技術(shù)在斑馬魚基因組編輯中的應(yīng)用得到了進(jìn)一步完善和簡(jiǎn)化（Dahlem et al,2012）。研究人員還發(fā)展了基于Golden Gate克隆來快速組裝 TALE重復(fù)單元的方法 （Cermak et al,2011）。同時(shí)，另一個(gè)研究組發(fā)展了能夠有效、靈敏檢測(cè)由TALENs所引入的突變頻率的方法，及高分辨率溶解分析（high resolution melt analysis）。使用該方法，所有注射了TALEN mRNA的斑馬魚胚胎均可在目標(biāo)位點(diǎn)引入突變，～90%的胚胎能夠發(fā)育成攜帶新突變的成體?；蚪M上的很多位點(diǎn)都能夠用這種方法引入突變，包括靠近端粒的gol基因及一些不表達(dá)的基因位點(diǎn)（Dahlem et al, 2012）。使用經(jīng)改造的Goldy TALEN骨架和斑馬魚遞送系統(tǒng)，改進(jìn)的TALEN技術(shù)可在斑馬魚體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中高效引入定點(diǎn)突變。某些位點(diǎn)的突變頻率～100%，且其中某些個(gè)體的兩個(gè)等位基因均可被引入突變（Bedell et al, 2012）。

3.1.2 體外培養(yǎng)人類細(xì)胞中的基因敲除

目前，已在多種體外培養(yǎng)人類細(xì)胞中運(yùn)用TALEN技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)敲除（Cermak et al,2011; Miller et al, 2011; Mussolino et al, 2011; Reyon et al, 2012; Sanjana et al, 2012）。如前所述，Cermak et al （2011）開發(fā)了能夠有效組裝TALEN重復(fù)單元的方法，同時(shí)還基于自然界TALEs的特性開發(fā)了用于人工設(shè)計(jì)TALENs的軟件。為了驗(yàn)證用這套方法所設(shè)計(jì)并合成的TALENs在人類細(xì)胞中的作用效果，他們針對(duì)人 HPRT1基因設(shè)計(jì)合成了一對(duì)TALEN，并用于人胚胎腎細(xì)胞（HEK293T）以檢測(cè)其在目的基因上引入定點(diǎn)突變的效果。結(jié)果表明，這對(duì)TALEN能夠在目的基因上通過對(duì)染色體上斷裂位點(diǎn)的不準(zhǔn)確NHEJ修復(fù)方式有效引入突變，共檢測(cè)到17種獨(dú)立突變類型，包括位于兩個(gè)TALEN之間的突變范圍在1～27 bp的替換和缺失。通過體外對(duì)天然TALE蛋白AvrBs4的大批突變型活性檢驗(yàn)，Mussolino et al（2011）建立了能夠高效剪切目的DNA的TALEN骨架，并基于此合成了針對(duì)CCR5和IL2RG兩個(gè)基因的TALENs。這兩個(gè)基因亦為此前在人HEK293T細(xì)胞中運(yùn)用ZFN技術(shù)進(jìn)行基因組編輯的位點(diǎn)，結(jié)果顯示，～45%的細(xì)胞在目標(biāo)位點(diǎn)被成功引入突變。TALEN技術(shù)在引入突變的效率方面與 ZFN技術(shù)相差不大，但細(xì)胞毒性顯著降低。Miller et al（2011）也構(gòu)建了能夠在人K562細(xì)胞中有效改變內(nèi)源基因NTF3和CCR5序列的TALEN骨架。首先, 以柑橘黃單胞桿菌（Xanthomonas axonopodis pathovar citri）來源的幾個(gè)天然TALEs的結(jié)構(gòu)建立了TALE骨架結(jié)構(gòu)，然后，根據(jù)所構(gòu)建的 TALE骨架結(jié)構(gòu)針對(duì) NTF3基因設(shè)計(jì)一對(duì)TALEN，并將其在人K562細(xì)胞中表達(dá)來檢測(cè)其在目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行基因修飾的效果。結(jié)果觀察到～9%的細(xì)胞在目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生基因突變，在NHEJ修復(fù)過程中，TALENs還可在K562細(xì)胞的NTF3基因位點(diǎn)引入寡核苷酸雙鏈。他們還在另外一個(gè)內(nèi)源基因CCR5證明了TALENs介導(dǎo)的基因修飾，并共針對(duì)CCR5基因設(shè)計(jì)了 4對(duì) TALENs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這 4對(duì)TALENs都能夠在K562細(xì)胞的CCR5位點(diǎn)有效引入突變，突變頻率＞20%。Sanjana et al（2012）利用分級(jí)鏈接原理建立了能夠快速構(gòu)建 TALEs的方法，該方法可在一周內(nèi)完成TALENs的構(gòu)建，且可同時(shí)構(gòu)建針對(duì)多個(gè)位點(diǎn)的TALENs。他們還建立了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)所構(gòu)建TALENs是否具有活性的方法，并使用該方法設(shè)計(jì)合成了針對(duì)人AAVS1基因的TALENs，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其能夠在人293FT細(xì)胞中對(duì)3.6%的細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)基因編輯。緊接著，Reyon et al（2012）也建立了基于固相連接可自動(dòng)化控制的高通量構(gòu)建 TALENs的方法，被稱為FLASH系統(tǒng)。對(duì)于組裝大量TALENs來說，F(xiàn)LASH系統(tǒng)既快速又經(jīng)濟(jì)。他們?cè)谌?U2OS細(xì)胞中使用eGFP報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了用FLASH系統(tǒng)組裝的48對(duì)TALENs的活性。結(jié)果顯示，這48對(duì)TALENs都能夠在目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行有效基因編輯。他們還用FLASH系統(tǒng)針對(duì) 96個(gè)可能與癌癥或者表觀遺傳調(diào)控相關(guān)的人類內(nèi)源基因組裝了TALENs，在U2OS細(xì)胞中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中84對(duì)TALENs能夠在目標(biāo)位點(diǎn)有效引入突變。以上結(jié)果顯示，F(xiàn)LASH系統(tǒng)可以使TALEN技術(shù)成為有效、快速、高通量的基因組編輯工具，且在目前技術(shù)條件下，這是ZFN技術(shù)所無法實(shí)現(xiàn)的。

3.2 基于同源重組的基因組編輯

TALEN技術(shù)的另一個(gè)重要應(yīng)用是當(dāng)其在基因組上產(chǎn)生雙鏈斷裂以后，可激發(fā)同源重組修復(fù)方式修復(fù)斷裂雙鏈，并在該過程中，于雙鏈斷裂位置插入一個(gè)外源DNA片段。這種基于同源重組的基因組編輯方式除了需要有位點(diǎn)特異的TALENs外，還需要一個(gè)攜帶有斷裂位點(diǎn)兩端遺傳信息的同源DNA臂來實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)內(nèi)源基因的定點(diǎn)矯正（少數(shù)核苷酸的改變）或者在一個(gè)特定的內(nèi)源位點(diǎn)插入一個(gè)新基因。

基于同源重組的TALEN基因組編輯技術(shù)已在酵母、斑馬魚、體外培養(yǎng)人類細(xì)胞以及人多能干細(xì)胞中得到了實(shí)現(xiàn)（Bedell et al, 2012; Hockemeyer et al, 2011; Li et al, 2011; Miller et al, 2011）。將一對(duì)TALENs在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生DSB，緊接著通過HR對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行基因組編輯的效率與ZFNs技術(shù)相差不大（Li et al, 2011）。Bedell et al（2012）改進(jìn)了TALEN系統(tǒng)，并基于該系統(tǒng)，在斑馬魚基因組中成功使用一個(gè)DNA寡核苷酸單鏈通過HR方式準(zhǔn)確將目標(biāo)位點(diǎn)DNA序列進(jìn)行了編輯，同時(shí)，還進(jìn)一步證明該編輯可通過生殖細(xì)胞傳遞到下一代。Miller et al（2011） 為證明所建立的TALEN骨架能夠通過HR進(jìn)行基因組編輯，從24對(duì)TALEN中選取通過NHEJ進(jìn)行基因組編輯時(shí)活性最高的兩對(duì)來進(jìn)行驗(yàn)證，將這兩對(duì)TALEN和一個(gè)能夠在目標(biāo)位點(diǎn)插入46 bp核苷酸的供體DNA片段轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞，觀察到多至16%的等位基因在目標(biāo)位點(diǎn)插入了46 bp的供體DNA片段。在人多能干細(xì)胞中進(jìn)行定點(diǎn)基因組編輯是充分發(fā)揮其潛能的前提，為檢測(cè)TALEN技術(shù)對(duì)人胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）和誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）進(jìn)行基因組編輯的效率，Hockemeyer et al（2009，2011）針對(duì)3個(gè)內(nèi)源基因PPP1R12C, OCT4和PITX3設(shè)計(jì)了TALENs，這3個(gè)基因此前也用ZFNs進(jìn)行過基因編輯。TALEN的表達(dá)質(zhì)粒和包含了同源序列的供體質(zhì)粒通過電穿孔法被轉(zhuǎn)入到ESCs和iPSCs中。共檢測(cè)5個(gè)基因組位點(diǎn)，結(jié)果顯示，在OCT4的第一個(gè)外顯子上，67%～100%的細(xì)胞在目標(biāo)位點(diǎn)插入了目的DNA片段，在OCT4的終止密碼子位點(diǎn)為2%～46%，在PPP1R12C位點(diǎn)為～50%，在PITX3基因（該基因在人多能干細(xì)胞中不表達(dá)）的起始密碼子位點(diǎn)為1%～13%，在PITX3基因的終止密碼子位點(diǎn)為19%～23%。這些效率跟此前用ZFNs對(duì)同樣位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯的效率很相近（Hockemeyer et al,2009）。值得注意的是，無論是在多能干細(xì)胞中還是在已分化細(xì)胞中，TALEN和ZFN技術(shù)都能夠在PPP1R12C得到很高的轉(zhuǎn)基因效率（Hockemeyer et al, 2011）?？傊?，這些研究說明TALEN技術(shù)是進(jìn)行基于同源重組的基因組定點(diǎn)編輯的有效工具。

雖然用ZFN技術(shù)進(jìn)行基于同源重組的基因定點(diǎn)矯正已在體外培養(yǎng)人類細(xì)胞、黑腹果蠅和植物中得到了實(shí)現(xiàn)（Urnov et al, 2010）, 但是，運(yùn)用TALEN技術(shù)進(jìn)行基因定點(diǎn)矯正目前還沒有報(bào)道。這種方式是通過TALENs在基因組上的特定位點(diǎn)產(chǎn)生DSB，然后再通過供體DNA片段在目標(biāo)位點(diǎn)上進(jìn)行單個(gè)或少數(shù)堿基的矯正。該技術(shù)可以通過對(duì)一些關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變來進(jìn)行基因功能和遺傳性疾病的研究。類似研究已經(jīng)由ZFN技術(shù)得到了實(shí)現(xiàn)（Urnov et al, 2010）。 基于TALEN技術(shù)的基因定點(diǎn)矯正也應(yīng)該能像ZFN技術(shù)一樣有效，但需要在將來的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 TALEN技術(shù)在基因組編輯應(yīng)用中的特異性及其優(yōu)勢(shì)

核酸酶的特異性對(duì)TALENs的廣泛應(yīng)用至關(guān)重要。通常來說，非特異剪切（脫靶效應(yīng)）會(huì)降低目標(biāo)位點(diǎn)的基因修飾，并導(dǎo)致細(xì)胞毒性。一個(gè)脫靶位點(diǎn)的存在就可能導(dǎo)致整個(gè)基因編輯的失敗，若用于疾病治療，則可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重副作用?？赡苡捎谠诨蚪M上存在多個(gè)脫靶位點(diǎn)而導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，ZFN技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用已受到了很大制約（Carroll,2008; Mani et al, 2005）。相比之下，TALENs對(duì)于其所識(shí)別DNA序列的堿基變化具有高度敏感性，3～4個(gè)堿基突變即可阻止TALENs與DNA的結(jié)合（Boch et al, 2009; Morbitzer et al, 2010; Zhang et al, 2011），即對(duì)于TALENs而言，脫靶效應(yīng)可能很有限。事實(shí)上，已有很多針對(duì)TALENs脫靶效應(yīng)的研究，且大部分研究顯示TALENs比ZFNs 具有更高的特異性和更小的細(xì)胞毒性。

脫靶效應(yīng)部分是由TALE蛋白的DNA結(jié)合域與DNA的非特異性結(jié)合所導(dǎo)致，部分是由FokI核酸內(nèi)切酶的非特異切割所導(dǎo)致。首先，要保證TALENs能夠有效剪切目的 DNA，兩個(gè) TALENs結(jié)合位點(diǎn)之間需要有合適的間隔距離以便 FokI能夠形成二聚體，該間隔距離也將影響TALE蛋白與DNA的非特異性結(jié)合。根據(jù)不同TALEN骨架結(jié)構(gòu)，已經(jīng)報(bào)道的合適間隔距離為 6～40 bp，但是，所有這些TALEN骨架結(jié)構(gòu)的最佳間隔距離為10～30 bp（Christian et al, 2010; Li et al, 2011; Miller et al, 2011;Mussolino et al, 2011）。有功能的間隔距離長(zhǎng)度范圍表明，在保證FokI能夠形成二聚體的情況下，設(shè)計(jì)TALEN蛋白所識(shí)別的DNA序列時(shí)具有一定的靈活性。根據(jù)Bogdanove & Voytas （2011）的評(píng)論，一個(gè)包含最短DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和最佳TALE蛋白與FokI之間連接距離的TALEN骨架的間隔距離范圍也較小，從而能夠提高其特異性。然而，通過系統(tǒng)設(shè)計(jì)和檢測(cè)不同識(shí)別位點(diǎn)長(zhǎng)度TALENs的活性后，并未發(fā)現(xiàn)TALENs識(shí)別位點(diǎn)長(zhǎng)度與其細(xì)胞毒性之間存在負(fù)相關(guān)（Reyon et al, 2012）。在以EGFP為報(bào)告基因的實(shí)驗(yàn)中，較短的 TALENs和較長(zhǎng)的TALENs具有同樣的剪切活性，但是，較短的TALENs通常具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。這可能是由于較短的TALENs更可能與非特異性位點(diǎn)結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)提示，通過合成更長(zhǎng)的 TALENs（例如包含14.5～19.5個(gè)重復(fù)單元）也許可以把TALENs的細(xì)胞毒性降到最低，但該假說需要進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，重復(fù)單元組成可能也會(huì)影響TALENs特異性。這是因?yàn)橥粋€(gè)核苷酸對(duì)不同 RVD的偏好性有差別，而且不同RVDs與其所識(shí)別的核苷酸之間的相對(duì)親和力也不同。研究提示一個(gè)TALE蛋白中應(yīng)該包含幾個(gè)（如3～4個(gè)）被適當(dāng)隔開的親和力較強(qiáng)的RVDs來保其完整活性（Streubel et al, 2012）。如果需要提高G的特異性，應(yīng)該選擇NH或者NK作為RVDs，但是，如果要提高TALEs的整體效率，就應(yīng)該選擇NN作為G的RVDs。如果一個(gè)TALE蛋白主要由親和力較弱的RVDs（如NI、NG或者NK）組成，設(shè)計(jì)時(shí)就需要更加小心，盡量使它也包含一些親和力較強(qiáng)的 RVDs（如 HD 或 NN）（Streubel et al,2012）。另外，由于FokI要形成二聚體才具有活性，所以要剪切雙鏈DNA就需要有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)彼此接近的 TALENs。也就是說，TALENs必須是在成對(duì)的時(shí)候才具有活性，這就使得TALENs在通常情況下都應(yīng)該具有很高的特異性。然而，當(dāng)在一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)兩個(gè)TALENs的時(shí)候，通過FokI的結(jié)合能夠使兩個(gè)TALENs形成同源和異源二聚體，但是，只有異源二聚體才具有我們需要的特異性。因此，同源二聚體的存在增加了TALENs進(jìn)行非特異性剪切的可能。為此，已有研究組對(duì)FokI進(jìn)行了改造，使得只有FokI的異源二聚體才具有剪切活性，在一定程度上降低了TALENs的脫靶效應(yīng)（Doyon et al,2011; Miller et al, 2007）。

雖然 TALENs的脫靶效應(yīng)還沒有經(jīng)過全面研究，但是，即使和野生型FokI融合，TALENs的細(xì)胞毒性相對(duì)于ZFNs來說可能較低。將四個(gè)酵母菌株分別用TALENs或者ZFNs處理以后進(jìn)行全基因組序列分析，僅發(fā)現(xiàn)了少數(shù)幾個(gè)可能是偶發(fā)的突變位點(diǎn)（Li et al, 2011）。Miller et al（2011）通過捕獲TALENs所結(jié)合的DNA片段發(fā)現(xiàn)所捕獲的DNA序列與 TALENs的識(shí)別序列一致。人干細(xì)胞通過TALEN技術(shù)進(jìn)行基因組編輯以后，研究人員檢測(cè)了19個(gè)最可能的TALENs脫靶位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其中的17個(gè)都沒有發(fā)生任何變化，剩下的兩個(gè)位點(diǎn)的突變率比靶位點(diǎn)分別低169及1 140倍。也就是說，即使有少數(shù)脫靶位點(diǎn)，TALENs在該位點(diǎn)的剪切效率也非常低（Hockemeyer et al, 2011）。比較TALEN和 ZFN技術(shù)在人 CCR5基因位點(diǎn)上的編輯效率發(fā)現(xiàn)，TALENs的細(xì)胞毒性顯著低于ZFNs，TALENs具有更高的特異性（Mussolino et al, 2011）。在斑馬魚中進(jìn)行的基因可遺傳敲除實(shí)驗(yàn)表明，9個(gè)可能的脫靶位點(diǎn)突變率并沒有高于對(duì)照組（Huang et al,2011），TALENs所表現(xiàn)的毒性與ZFNs并沒有顯著差異（Sander et al, 2011），且脫靶效應(yīng)發(fā)生的頻率非常低，不會(huì)對(duì)目的基因功能研究產(chǎn)生影響（Dahlem et al, 2012）。大鼠實(shí)驗(yàn)中的9個(gè)可能的脫靶位點(diǎn)中，只有一個(gè)檢測(cè)到突變（Tesson et al,2011）。通過不斷完善檢測(cè) TALENs脫靶效應(yīng)的技術(shù)，也許會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的脫靶位點(diǎn)（Gabriel et al, 2011;Pattanayak et al, 2011）。就像最近用ZFNs在人多能干細(xì)胞中（Yusa et al, 2011）以及用TALENs在酵母中（Li et al, 2011）所做的基因修飾研究一樣，全外顯子組或者全基因組測(cè)序?qū)⑹菣z測(cè)脫靶位點(diǎn)的有效方法。

4 結(jié) 論

TALE蛋白模塊化結(jié)構(gòu)與一一對(duì)應(yīng)DNA識(shí)別法為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和模式生物中進(jìn)行位點(diǎn)特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因組編輯提供了極具吸引力的解決方案。這種序列特異的DNA結(jié)合蛋白能夠特異性與目的DNA結(jié)合，而且對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來說，可以用經(jīng)濟(jì)的分子生物學(xué)技術(shù)在短短幾天內(nèi)合成所需要的TALE蛋白。盡管如此，TALE蛋白的更廣泛應(yīng)用仍需對(duì)很多問題進(jìn)一步深入研究。包括TALE蛋白與 ZF蛋白相比具有哪些優(yōu)勢(shì)、TALE蛋白與DNA特異性結(jié)合的機(jī)制、造成TALE蛋白脫靶效應(yīng)的因素以及在體內(nèi) TALE蛋白與甲基化的 DNA的親和性如何等。TALENs能否像 ZFNs一樣能夠被有效用于臨床實(shí)驗(yàn)也需要進(jìn)一步研究。從作用機(jī)制上來說，需要特別關(guān)注表觀遺傳修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及其他一些DNA結(jié)合蛋白的存在是否會(huì)影響TALEs的功能和特異性，TALEs與DNA結(jié)合的調(diào)控機(jī)制目前也不清楚。對(duì)TALEs與DNA相互作用的分子基礎(chǔ)的深入研究將有助于提高TALEs在應(yīng)用上的準(zhǔn)確性、特異性和效率。由于TALEs能夠有效地將轉(zhuǎn)錄激活因子（如VP16）固定在特定內(nèi)源基因的啟動(dòng)子上來激活目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，因此，其它的一些功能性分子，如重組酶和表觀遺傳修飾酶，也應(yīng)該同樣可用于對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行基因組操控?？傊?，基于TALEs的基因組操控技術(shù)將為科研人員、臨床醫(yī)師和技術(shù)人員提供一種全新的、程序化的和精確的基因組操控技術(shù)。

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