趙 萍, 田 晶, 費(fèi) 旭, 徐 龍 權(quán), 李 景, 喻 毅

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.大連工業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代教育技術(shù)部, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

刺五加為五加科植物,刺五加的根、莖、葉皆可作藥用。目前對(duì)刺五加根及根莖的研究報(bào)道較多,而對(duì)更具開(kāi)發(fā)價(jià)值的刺五加葉的研究較少[1]。近年研究表明,刺五加葉中含有豐富的皂苷類、黃酮類化合物等多種活性物質(zhì),其皂苷類成分主要是以齊墩果酸為配基的三萜皂苷[2]。皂苷除用作藥物外,還可以作為高級(jí)化妝品和食品添加劑。因此,開(kāi)展對(duì)刺五加皂苷的提取工藝的研究具有十分重要的意義[3]。

目前報(bào)道的刺五加皂苷提取方法主要有回流浸提法[4]、超聲法[5]、微波法[6]等。超聲法和微波法具有快速、高效等特點(diǎn),但目前較難應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。有機(jī)溶劑回流浸提法易于操作、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),但其工藝條件還有待進(jìn)一步優(yōu)化,尤其是純化步驟更需要改進(jìn)。本論文以刺五加葉為原料,針對(duì)刺五加皂苷提取工藝存在的問(wèn)題,將有機(jī)溶劑回流浸提與大孔吸附樹(shù)脂法相結(jié)合,改進(jìn)了提取工藝,優(yōu)化了純化方法,為刺五加皂苷的規(guī)?；a(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試 劑

刺五加葉,河北中藥之家藥材店；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品,上海晶純實(shí)業(yè)有限公司,純度>98%；AB-8大孔吸附樹(shù)脂,天津南開(kāi)合成科技有限公司；乙醇、石油醚、正丁醇、香草醛、甲醇、濃硫酸等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

Lambda-35紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),美國(guó)PE公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠；TGL-16高速冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī),北京比朗實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 刺五加皂苷的提取純化方法

取一定量粉碎后的刺五加葉,用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇回流浸提一定時(shí)間,然后,依次進(jìn)行減壓抽濾、石油醚脫色素、正丁醇萃取、濃縮,濃縮后的提取液減壓蒸餾除去正丁醇溶液。提取物進(jìn)一步采用AB-8大孔樹(shù)脂柱層析法對(duì)提取到的刺五加皂苷進(jìn)行純化。先用一定量的去離子水洗脫多糖等雜質(zhì),棄去洗脫液,再用不同濃度的乙醇洗脫刺五加皂苷,洗脫液經(jīng)減壓濃縮,真空冷凍干燥,即得刺五加皂苷[7]。

η=m1/m0×100%

式中:η為刺五加皂苷的得率,%；m1為提取所得的刺五加皂苷質(zhì)量,g；m0為刺五加原料的質(zhì)量,g。

1.3.2 刺五加皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用紫外-可見(jiàn)分光光度法[2]分析檢測(cè)刺五加皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.010 g,用甲醇溶解并定容至10.0 mL, 即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密吸取質(zhì)量濃度為2 mg/mL的樣品溶液110 μL置于10.0 mL具塞試管中,水浴揮去溶劑。加入新配置的8%香草醛-乙醇溶液0.5 mL,72%硫酸5 mL搖勻閉塞后,置于60 ℃恒溫水浴10 min,立即取出試管,放入冰水中冷卻15 min,取出搖勻,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于400～600 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸收曲線,同時(shí)以甲醇溶液代替樣品溶液作空白對(duì)照,確定最大吸收波長(zhǎng)[8]。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液30、50、70、90、100 μL,分別置于具塞試管中,其余步驟同“1.3.2.2”,然后在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,同時(shí)甲醇溶液作空白對(duì)照。以齊墩果酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.4 皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算

w=m2/m1×100%

式中:w為刺五加皂苷皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù),%；m2為提取物中刺五加皂苷的質(zhì)量,g；m1為刺五加皂苷提取物的質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

由于刺五加皂苷的測(cè)定波長(zhǎng)在520～550 nm不等,因此對(duì)刺五加葉皂苷的測(cè)定波長(zhǎng)進(jìn)行優(yōu)化,在400～600 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描,結(jié)果如圖1所示。圖1中表明標(biāo)準(zhǔn)品和刺五加樣品與香蘭素-濃硫酸反應(yīng)生成的產(chǎn)物均在537 nm處有最大吸光度,因此確定537 nm為最大吸收波長(zhǎng)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及刺五加皂苷紫外-可見(jiàn)光譜波長(zhǎng)掃描圖

Fig.1 UV-Vis wavelength scanning of standard sample andAcanthopanaxsenticosussaponins

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,吸光度Y與皂苷質(zhì)量濃度X(mg/mL)之間的回歸方程為:Y=5.462X+0.002,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0,線性關(guān)系良好。

2.3 刺五加皂苷的提取條件

2.3.1 提取溫度

稱取10.0 g干燥刺五加粉5份,置于5個(gè)250 mL的圓底燒瓶中,用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取劑,按1∶10(g/mL)的料液比分別在40、50、60、70、80 ℃條件下回流提取2 h,然后進(jìn)行純化步驟,洗脫體積流量為27.22×10-6m3/min,洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50%,洗脫液減壓蒸餾,濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)刺五加皂苷提取的影響

從圖2可以看出,60 ℃條件下刺五加皂苷的得率最高,但皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高,而80 ℃條件下皂苷得率相對(duì)較高,皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)也最高。此外,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度高于80 ℃,提取液沸騰,有乙醇損失,給后續(xù)操作帶來(lái)不便,同時(shí)增大了成本。故確定80 ℃為皂苷提取效果最好的溫度。

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)

稱取10.0 g干燥刺五加粉5份,置于5個(gè)250 mL的圓底燒瓶中,然后向其加入體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、75%、80%的乙醇,按1∶10的料液比,在溫度為80 ℃時(shí)回流提取刺五加皂苷2 h,經(jīng)純化后,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)刺五加皂苷提取的影響

由圖3可以看出,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)刺五加皂苷的得率最高,皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)也最高,故選取最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.3.3 料液比

稱取10.0 g干燥刺五加粉5份,置于5個(gè)250 mL的圓底燒瓶中,然后向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液,料液比分別為1∶6、l∶7、1∶8、1∶9、1∶10搖勻,在溫度為80 ℃時(shí)回流提取刺五加皂苷2 h,經(jīng)純化后,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)刺五加皂苷提取的影響

由圖4可以看出,料液比為1∶6的刺五加皂苷的得率最高,而超過(guò)1∶6時(shí)料液比呈下降的趨勢(shì),可能是由于刺五加葉中的刺五加皂苷大量溶于提取劑乙醇溶液當(dāng)中,說(shuō)明刺五加中的有效成分的提取已經(jīng)比較充分,繼續(xù)增加料液,含量沒(méi)有多大的變化,反而增加了濃縮的時(shí)間,損失量相對(duì)也會(huì)增加。而采用料液比為1∶5進(jìn)行回流提取時(shí),所得提取液太少,在實(shí)驗(yàn)操作中不可行。從皂苷含量角度出發(fā),料液比1∶6、1∶7和1∶8相比較,皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別不大。此外,由于刺五加粉末的吸濕性強(qiáng),考慮原料節(jié)省因素,故選取1∶6 的料液比為最佳料液比。

2.3.4 提取時(shí)間

稱取10.0 g干燥刺五加粉5份,置于5個(gè)250 mL的圓底燒瓶中,然后向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液,按 1∶6的料液比,分別在80 ℃ 水浴中回流提取刺五加皂苷2、3、4、5、6 h,經(jīng)純化后,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)刺五加皂苷提取的影響

由圖5可以看出,隨著提取時(shí)間的增加,刺五加皂苷的得率也隨之增高,且皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)也是呈上升的趨勢(shì)。但是,若浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng),一些大分子物質(zhì)溶出,造成提取液的顏色變深,一些活性成分被破壞,不利于皂苷的提取,因此選擇提取時(shí)間為5 h。

2.4 純化工藝

2.4.1 樣品制備及預(yù)處理

精密稱取干燥的刺五加葉粉末10.0 g,按最佳工藝條件提取,提取液經(jīng)過(guò)濾、脫色素濃縮、減壓蒸餾除去正丁醇,用水溶解后作為樣品液。

2.4.2 洗脫液體積流量的確定

樣品液加入預(yù)處理好的層析柱,反復(fù)吸附,去離子水脫雜質(zhì)后,用乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%的洗脫液分別以6.8×10-6、13.61×10-6、20.42×10-6、27.22×10-6、34.03×10-6m3/min 的體積流量洗脫皂苷,分別收集洗脫液,冷凍干燥后分析結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 洗脫液體積流量對(duì)刺五加皂苷純化的影響

由圖6可以看出,洗脫液體積流量在27.22×10-6m3/min 時(shí),刺五加皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,且皂苷得率也是最高的。因此,選擇27.22×10-6m3/min為最佳體積流量。

2.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

樣品液加入預(yù)處理好的AB-8樹(shù)脂柱,反復(fù)吸附,去離子水脫雜質(zhì)后,用體積流量為27.22×10-6m3/min ,體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%的乙醇作為洗脫劑洗脫吸附在大孔樹(shù)脂上的刺五加皂苷,結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),刺五加皂苷的得率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)都達(dá)到最高。因此,選取最佳乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖7 洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)刺五加皂苷純化的影響

Fig.7 Purification ofAcanthopanaxsenticosussaponins in different ethanol elution volume fraction

3 結(jié) 論

考察了提取溫度、浸提時(shí)間、乙醇的體積分?jǐn)?shù)和料液比4個(gè)因素對(duì)刺五加皂苷提取結(jié)果的影響；優(yōu)化了乙醇的體積流量及體積分?jǐn)?shù)等大孔吸附樹(shù)脂法純化刺五加皂苷的工藝；采用紫外-分光光度法對(duì)刺五加皂苷進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明,最佳提取條件為:浸提溫度80 ℃,浸提時(shí)間5 h,乙醇的體積分?jǐn)?shù)70%,料液比1∶6；最佳純化條件為:乙醇的體積流量27.22×10-6m3/min,洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)60%。在最優(yōu)提取純化條件下,刺五加皂苷的得率為5.9%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.1%。

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