張春梅，陳杰昌，張喜軍

披針葉黃華（Thermopsis lanceolate）別名叫牧馬豆或野決明，多年生草本，全世界約有30種，我國有8種及3變種，主要分布于東北、華北、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、寧夏、青海、新疆、四川等地區(qū)，俄羅斯、蒙古也有分布。生于河岸草地、沙丘、林下灌叢中以及田邊、路邊，偶進(jìn)入農(nóng)田［1］。全草藥用，能去痰，止咳，有興奮呼吸，升高血壓的功效，主治祛痰止咳［2］。其毒性為全草有毒，產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)興奮和氣官刺激癥狀［3］。在藥學(xué)上，傳統(tǒng)日用化工及精細(xì)化工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，具有極好的開發(fā)利用價(jià)值。通過植物組織培養(yǎng)方法快速繁殖披針葉黃華，不但加速品種繁育速度，還可擴(kuò)大種質(zhì)資源，保持優(yōu)良品種的特性。種子是建立植物無菌體系的良好外植體［4］。但披針葉黃華種子種皮太硬，出苗時(shí)間長［5］。本研究采用披針葉黃華種子作為試材，探討了培養(yǎng)基中不同種類、濃度碳源和激素對(duì)披針葉黃華種子無菌苗萌發(fā)的影響，為今后其組織培養(yǎng)或新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

披針葉黃華種子，MS培養(yǎng)基、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、果糖，6－BA、NAA、2，4－D。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別加入碳源（葡萄糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、果糖），激素（6－BA、NAA、2，4－D），碳源分別設(shè)120、160、200、240mg／L 四個(gè)濃度，激素分別設(shè)0.2、0.4、0.6、0.8 、1.0mg／L 五個(gè)濃度，不加碳源、激素為對(duì)照。將配比好的培養(yǎng)基pH調(diào)至6.8，分裝到罐頭瓶中，121℃滅菌20min。

1.2.2 種子處理 將披針葉黃華種子用紗布包好，置于自來水沖洗10min，瀝干水分后，置于超凈工作臺(tái)上，取225粒種子置于75%的酒精溶液中消毒1min，無菌水沖洗5次，用含量8%～9%NaClO的活性氯消毒6min，再將種子用紗布包好放在無菌水中充分沖洗5次，瀝干置于接種盤上備用。

1.2.3 置床及發(fā)芽 預(yù)先將處理好的披針葉黃華種子接種到含有不同濃度碳源（葡萄糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖、果糖）不同濃度激素（6－BA、NAA、2，4－D）的 MS培養(yǎng)基中，每瓶3粒，3次重復(fù)。置于27℃光照強(qiáng)度為2 000Lx恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)7d，觀察其生長，測(cè)量幼苗生長長度，比較不同種類、濃度碳源以及激素對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長的影響。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用DPS9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同碳源對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響

2.1.1 不同濃度葡萄糖碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表1可知，在各濃度葡萄糖碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子均能萌發(fā)為無菌苗，但低濃度葡萄糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度葡萄糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳葡萄糖濃度為160mg／L，與濃度為240mg／L差異顯著，說明披針葉黃華無菌苗不宜在較高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中生長。

表1 不同濃度葡萄糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

2.1.2 不同濃度蔗糖碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表2可知，在各濃度蔗糖碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能萌發(fā)為無菌苗，但低濃度蔗糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度蔗糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳蔗糖濃度為200mg／L，與濃度為240、160mg／L差異顯著，與濃度為120mg／L存在極顯著差異，說明披針葉黃華無菌苗不適宜在較高或較低濃度蔗糖培養(yǎng)基中生長。

表2 不同濃度蔗糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

2.1.3 不同濃度山梨醇碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表3可知，在各濃度山梨醇碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能萌發(fā)為無菌苗，但低濃度山梨醇對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度山梨醇對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳山梨醇濃度為160mg／L，與濃度為200、120mg／L間差異顯著，與濃度為240mg／L存在極顯著差異，說明披針葉黃華無菌苗不宜在較高或較低濃度山梨醇培養(yǎng)基中生長。

表3 不同濃度山梨醇對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

2.1.4 不同濃度海藻糖碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表4可知，在各濃度海藻糖碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能萌發(fā)為無菌苗，低濃度海藻糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度海藻糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳海藻糖濃度為200mg／L，但與濃度為240、160mg／L差異不顯著，與濃度為120mg／L差異顯著，說明披針葉黃華無菌苗不宜在較低濃度海藻糖培養(yǎng)基中生長。

表4 不同濃度海藻糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

2.1.5 不同濃度果糖碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表5可知，在各濃度果糖碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能萌發(fā)為無菌苗，低濃度果糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度果糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳果糖濃度為160mg／L，但與濃度為120、200mg／L間差異不顯著，與濃度為240mg／L差異顯著，說明披針葉黃華無菌苗不宜在較高濃度果糖培養(yǎng)基中生長。

表5 不同濃度果糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

由表6可知，在最佳濃度的不同碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能生長成無菌苗，無菌苗在濃度為160mg／L的葡萄糖碳源的培養(yǎng)基上生長最快（表1）。與濃度為200mg／L的蔗糖存在差異，其次為160mg／L的山梨醇和果糖培養(yǎng)基，200mg／L的海藻糖次之，對(duì)照最差。

表6 不同碳源最適濃度顯著性分析

用葡萄糖、山梨醇、果糖作為碳源時(shí)披針葉黃華無菌苗生長的最佳濃度為160mg／L，而當(dāng)碳源為蔗糖、海藻糖作為碳源時(shí)，其最佳濃度為200 mg／L。由此可見，培養(yǎng)基中碳源種類不同時(shí)，其對(duì)應(yīng)最佳濃度亦不同。

表7 披針葉黃華無菌苗在不同碳源培養(yǎng)基中平均生長速度差異性分析

由表7可知，披針葉黃華無菌苗生長的最佳碳源為山梨醇、蔗糖、葡萄糖，其次為果糖與海藻糖。

2.2 不同激素濃度對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響

由表8、9可以看中，當(dāng)6－BA與NAA或2，4－D以一定比配合使用時(shí)，有些培養(yǎng)基能誘導(dǎo)出無菌苗，且6－BA的愈傷誘導(dǎo)能力明顯強(qiáng)于NAA。0.2mg／L 6－BA ＋0.8mg／L NAA 誘導(dǎo)率達(dá)到22.5%，無菌苗生長率最佳培養(yǎng)基為改良 MS基本培養(yǎng)基0.8mg／L NAA＋0.4mg／L 6－BA，其誘導(dǎo)率達(dá)到26.7%。這足以說明披針葉黃華無菌苗誘導(dǎo)依賴NAA與6－BA的組合。由此可見，不同基因型、不同外植體來源和激素的配比對(duì)植物無菌苗的誘導(dǎo)差異很大。

表8 6－BA與NAA的不同濃度配比對(duì)披針葉黃華無菌苗的影響

表9 6－BA與2、4－D的不同濃度配比對(duì)披針葉黃華無菌苗的影響

3 討論

3.1 不同激素對(duì)種子無菌苗的影響

無菌苗形成過程是一個(gè)植物基因型、外植體來源、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等諸多因素之間相互作用的復(fù)雜過程，其中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、含量及組成比例是調(diào)控植物器官產(chǎn)生無菌苗的主導(dǎo)因素［6］。在很多植物中，誘導(dǎo)愈傷時(shí)使用較多的是單獨(dú) 2，4－D［7－8］或者 2，4－D 和 6－BA 組合［9－10］。而橡膠樹花藥無菌苗的誘導(dǎo)以2，4－D和KT的組合為主［11］。而中國植物研究所通過添加0.5mg／L NAA＋1.0mg／L 6－BA＋1.2 mg／L 2，4－D 3種激素的組合來誘導(dǎo)葉片無菌苗的產(chǎn)生，但是愈傷誘導(dǎo)率的大小在文章中未見有說明［12］。

3.2 碳源對(duì)種子無菌苗的影響

眾所周知，不同的培養(yǎng)基所含的營養(yǎng)物質(zhì)的成分不同，且同一培養(yǎng)基中不同的糖濃度對(duì)同一種外植體的作用不同。在植物組織培養(yǎng)中，外植體無菌苗的形成與培養(yǎng)基的成分等都密不可分。文心蘭的不同生長發(fā)育時(shí)期所需蔗糖濃度不一。在一定范圍內(nèi)提高糖濃度對(duì)文心蘭各誘導(dǎo)生長階段有明顯的促進(jìn)作用。組織培養(yǎng)試驗(yàn)證明培養(yǎng)基中高滲透勢(shì)或液體培養(yǎng)基有利于營養(yǎng)素和激素的運(yùn)轉(zhuǎn)，有利于根的發(fā)生和形成質(zhì)量。植物組織培養(yǎng)中，在植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中，一般采用蔗糖、果糖和葡萄糖作為碳源。糖對(duì)次生代謝的作用，首先表現(xiàn)在不同的碳源對(duì)次生代謝產(chǎn)物的積累及細(xì)胞的生長不一致［13］。植物離體細(xì)胞作為生物反應(yīng)器具有生產(chǎn)周期短、易規(guī)?；⒉皇芡饨绛h(huán)境干擾而且產(chǎn)量高、化學(xué)穩(wěn)定性和化學(xué)特性好等特點(diǎn)［14］，利用植物離體細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)一直受到學(xué)術(shù)界的重視，也取得了很大進(jìn)展（如紫草寧、人參皂甙、紫杉醇等）［15－16］。無菌苗經(jīng)長期繼代后分化能力的保持問題，一直是細(xì)胞工程研究中的重要課題［17］。已有不少報(bào)道指出，無菌苗長期繼代后，分化能力降低是較為普遍的現(xiàn)象［18］，像胡蘿卜、煙草和水稻，在繼代多次后，無菌苗分化植株的能力就會(huì)完全消失［19－20］也有一些植物的無菌苗在繼代中，它們分化能力是可以很好保持的。如玉米，花粉無菌苗繼代2年后仍有很強(qiáng)的植株再生能力［21］，而無菌苗，有的品種繼代保存了近10年了，仍有很強(qiáng)的再生能力，而有的品種剛剛誘導(dǎo)出無菌苗不長時(shí)間后，就喪失再生能力。其原因可能與披針葉黃華的基因型有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，改變碳源能夠誘導(dǎo)體胚發(fā)生［22－23］。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同碳源對(duì)披針葉黃華無菌苗生長的影響各異。葡萄糖和蔗糖有利于披針葉黃華無菌苗的生長，山梨醇和果糖對(duì)披針葉黃華無菌苗的生長影響較小，而海藻糖不利于披針葉黃華無菌苗的生長。披針葉黃華無菌苗在不同碳源培養(yǎng)基上的生長能力大小不同。其機(jī)理有待于進(jìn)一步探討。

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