陳經(jīng)雕，劉美真，柯碧霞，譚海玲，李柏生，柯昌文

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種能在豬群中正常攜帶，偶爾導致豬、人發(fā)病的人獸共患的動物源性微生物。根據(jù)其莢膜多糖抗原的異同劃分為35個血清型，其中豬鏈球菌2型為優(yōu)勢致病血清型，而不同豬鏈球菌2型菌株間的致病力又存在明顯的差異，這種差異可能與各菌株所攜帶的毒力因子有很大關(guān)系［1］。目前認為豬鏈球菌2型的毒力因子主要包括莢膜多糖（cps2J）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、溶血素（sly）、谷氨酸脫氫酶（gdh）、胞外因子（ef）、纖連蛋白／血纖蛋白原結(jié)合蛋白（FBPS）和毒力相關(guān)序列ORF2等［2］。為了解廣東地區(qū)豬鏈球菌2型菌株毒力基因分布及分子分型情況，本研究選取了其中5個毒力基因?qū)ξ沂》蛛x自病人和病豬的豬鏈球菌2型菌株進行PCR檢測分析，并對菌株進行MLST分子分型，為診斷、治療和制定豬鏈球菌疫情防控措施提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗菌株 2005－2008年共22株，其中17株來自病人（其中2005年5株分別來自潮州、陽江、深圳、韶關(guān)和佛山，2006年5株分別來自江門、廣州、佛山、中山和惠州，2007年7株分別來自佛山、江門、深圳各2株和廣州1株），5株來自病豬（均為2008年分別來自肇慶2株、河源、茂名、惠州各1株），陽性對照的豬鏈球菌2型標準株SS2（來自德國）核酸由江蘇省疾控中心惠贈。

1．2 試劑來源 診斷血清購自丹麥（STATENS SERUM INSTITUT）公司，API 20Strep生化鑒定試驗條購自法國梅里埃公司，分子生物學試劑購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司，引物由上海生工公司合成，均在有效期內(nèi)使用。測序反應用PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（v3．1，ABI）試劑盒，操作按試劑盒說明書進行。

1．3 實驗方法

1．3．1 菌株鑒定［3］從菌落形態(tài)、血清學實驗及API 20Strep生化鑒定分別對菌株進行種、型鑒定。1．3．2 毒力因子檢測［3］

1．3．2．1 菌株DNA提取 用煮沸法或細菌基因組DNA試劑盒提取所有菌株的基因組DNA，試劑盒提取可參考說明書操作。

1．3．2．2 引物 見表1。

表1 5個毒力基因的引物序列及產(chǎn)物大小Tab．1 Five virulence genes’primer sequences and product sizes

1．3．2．3 PCR反應體系 反應體系為25μL，10×PCR Premix緩沖液12．5μL，上、下游引物（10 mmol／L）各1μL，模板2μL，用去離子水調(diào)整終體積至25μL。反應結(jié)束后各取5μL于1% 瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1．4．1 多位點序列分析（MLST）

1．4．1．1 提取細菌基因組DNA 按照細菌DNA提取試劑盒說明書嚴格操作，提取的基因組－20℃保存待用。

1．4．1．2 PCR 擴增、測序、數(shù)據(jù)分析 參照文獻［4－5］分 別 用 PCR 擴 增 aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA和thrA7個管家基因DNA片段，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后測序。各管家基因序列經(jīng)DNA star SeqMan軟件處理后與數(shù)據(jù)庫http：／／ssuis．mlst．net／進行比對，獲得各位點的等位基因數(shù)值，并形成相應的菌株等位基因譜，提交MLST 網(wǎng)站，確定序列分型（Sequence Type，ST）。

2 結(jié) 果

2．1 菌株鑒定 對22株菌株進行菌落形態(tài)、血清學實驗及API 20Strep生化鑒定，全部菌株均為豬鏈球菌2型。

2．2 毒力基因檢測 22株菌分為5種毒力基因型，其中病人及病豬菌株均有cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋型別（病人7株、病豬3株），cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh－／ef＋ （6 株）、cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh＋／ef＋（4株）為病人分離株所特有，cps2J＋／mrp－／sly＋／gdh＋／ef＋（1株）、cps2J＋／mrp－／sly－／gdh＋／ef－（1株）為病豬分離株所特有，圖1為部分菌株的cps2J基因片段結(jié)果。結(jié)果見圖1、表2。

2．3 MLST分型 對所有菌株的7個管家基因片段進行擴增，經(jīng)測序、比對分析顯示，均能夠在數(shù)據(jù)庫找到對應的基因型，共有3個基因型，分別為ST1型（病人9株、病豬2株）、ST7型（病人8株、病豬2株）和ST28（病豬1株）型，其中ST1、ST7型菌株親緣關(guān)系極近，均同屬于ST1克隆復合物。結(jié)果見圖2。

表2 廣東地區(qū)豬鏈球菌2型的毒力基因類型Tab．2 Detection of virulence genes in Ss2in Guangdong

圖1 部分菌株夾膜多糖基因片段（cps2J）結(jié)果 －450bpFig．1 Strains capsular polysaccharide gene fragment（cps2J）－450bpThe 1－7are part of strains from patients；8－10 are part of isolates from sick pigs

圖2 廣東地區(qū)豬鏈球菌2型菌株MLST分型聚類圖Fig．2 MLST type cluster map of Streptococcus suis type 2in Guangdong Province

3 討 論

豬鏈球菌2型菌株曾引起我國1998年江蘇省和2005年四川省的部分地區(qū)的人感染豬鏈球菌病疫情的暴發(fā)流行。廣東省豬鏈球菌在豬間的流行早有報告，但從病原學上證實人感染豬鏈球菌2型尚屬首次［6］，且與江蘇、四川人感染豬鏈球菌病疫情暴發(fā)不同，廣東地區(qū)的豬鏈球菌2型菌株均來源于散發(fā)的病例和病豬。

研究發(fā)現(xiàn)并不是所有的豬鏈球菌2型菌株都具有致病性，其致病力取決于它的毒力因子，根據(jù)菌株毒力因子的差異，將其分為強毒力株、弱毒力株和無毒力株，其致病機理目前還不很清楚，但普遍認為其致病力的差異與該菌株的毒力因子分布有著密切的關(guān)系［7］。Cps2J是豬鏈球菌2型菌株抵抗巨噬細胞吞噬的重要物質(zhì)，在豬鏈球菌致病過程中有重要作用，也是豬鏈球菌進行分型的標志。Smith等［8］研究發(fā)現(xiàn)通過插入突變得到的無莢膜的等位基因突變株在體外很容易被豬肺泡巨噬細胞攝入，更重要的是，通過鼻腔接種無菌仔豬的突變株對其完全無致病性，由此可見，莢膜多糖與菌株的致病力有關(guān)。

mrp與ef也是豬鏈球菌2型菌株重要的毒力因子，曾巧英等［9］研究證明mrp可單獨作為豬鏈球菌2型菌株的毒力因子。豬鏈球菌血清型眾多，ef與血清型有相關(guān)性，ef是一種粘附素，能黏附上皮細胞并誘導上皮細胞融合和凋亡［10］。Henk J等［11］研究歐洲的豬鏈球菌菌株結(jié)果顯示：豬鏈球菌血清1型、2型、1／2型和14型菌株表達ef蛋白的百分率很高，菌株的毒力可能與ef相關(guān)。本研究中除了1株來自病豬的菌株為ef陰性外，其余菌株均為ef陽性。由于mrp和ef在強毒力菌株中檢出率很高，在無毒力菌株中檢出率很低，因而攜帶mrp和ef常被認為是豬鏈球菌2型高致病性的標志［12］。Vecht U［13］等研究發(fā)現(xiàn)mrp＋、epf＋ 的表現(xiàn)型菌株感染小豬時可以引起典型的腦炎、多發(fā)性漿液炎及多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，而mrp－、ef－的表現(xiàn)型菌株對豬則沒有致病力。本研究中的菌株mrp＋、epf＋ 高達90．9%（20／22），其中1株來自病豬的菌株為mrp－、ef－，這可能是由別的毒力基因所導致發(fā)病。

Sly對Hep22細胞、內(nèi)皮細胞和Vero細胞均具有一定的毒性作用，且經(jīng)純化后溶血素免疫的小鼠和豬均能耐受強毒力株的攻擊，所以推測其可能也是豬鏈球菌2型的一種重要的致病因子，也是一種保護性抗原［14］。然而，豬鏈球菌2型的溶血素基因分布具有很強的地域性，來自歐洲的大多數(shù)菌株能產(chǎn)生溶血素，而來自北美的菌株不產(chǎn)生溶血素，但仍然具有致病性［1］。本研究中的菌株sly＋ 只有50．0%（11／22）。據(jù)相關(guān)研究證實基于gdh蛋白的檢測可區(qū)分豬鏈球菌2型的強毒力株、弱毒力株和無毒力株，同時，gdh也與豬鏈球菌的種屬有關(guān)［15］。

本研究通過對廣東地區(qū)病人、病豬的豬鏈球菌2型分離株進行上述5種主要毒力因子的PCR檢測，研究發(fā)現(xiàn)22株菌株包含了5種毒力基因型，其中cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋型別為病人及病豬菌株所共有，共占45．5%（10／22），cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh－／ef＋、cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh＋／ef＋為病人菌株所特有，各占27．3%（6／22）、18．2%（4／22），cps2J＋／mrp－／sly＋／gdh＋／ef＋、cps2J＋／mrp－／sly－／gdh＋／ef－為病豬菌株所特有，各占4．5%（1／22）、4．5%（1／22），這就提示我省目前豬鏈球菌2型流行菌株的毒力基因型主要為同時具有上述5種毒力基因的基因型，但低于趙冉等［16］研究的5種毒力基因96% 均為陽性的結(jié)果。本次研究的病例中有兩例（毒力基因型別分別為：cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋、cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh－／ef＋）死亡，共占本次研究的毒力基因型別的72．8%（16／22）。但由于分離的菌株數(shù)量較少，且收集到病例、病豬的臨床表現(xiàn)和病理改變資料也有限，因此廣東地區(qū)的豬鏈球菌2型分離株是否還有更多的毒力基因型，各種毒力基因型的菌株與臨床病人或病豬的臨床表現(xiàn)和病理改變有何關(guān)聯(lián)等，還有待對更多的豬鏈球菌2型分離株進行檢測研究。本研究結(jié)果表明廣東地區(qū)豬鏈球菌2型菌株毒力基因型呈現(xiàn)多樣化，部分毒力基因型為病人及病豬所共有，cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋型別是目前廣東地區(qū)豬鏈球菌2型菌株毒力基因型別的優(yōu)勢型別。

多位點序列分型技術(shù)（multilocus sequence typing，MLST）是基于PCR擴增、基因測序的基因分型方法。MLST方法具有很高的分辨能力，不需用參考菌株對實驗室間和實驗室內(nèi)的結(jié)果進行標準化，適用于流行病學研究［17］。并且可以通過互聯(lián)網(wǎng)進行快速的數(shù)據(jù)共享，有利于全球范圍的流行病學的比較與分析。King S J等［18］對英國294株豬鏈球菌分離株進行了MLST分析，共獲得了92個序列型（ST），其中ST1克隆復合物是最主要的ST分組，它包含了全世界各地的絕大多數(shù)的高致病性分離株，ST1型多來自腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和敗血癥的樣本，ST27、ST87型則主要來自肺臟，與臨床背景相關(guān)良好。Princivalli M S等［19］對意大利2003－2007年分離的菌株研究時也發(fā)現(xiàn)ST1型主導著這幾年的流行，并且大都攜帶mrp、ef和sly基因。與歐洲報道相比，我國分離株則以ST7型為主，其次是ST1型。葉長蕓等對國內(nèi)兩次暴發(fā)（1998年江蘇、2005年四川）的豬鏈球菌進行研究，發(fā)現(xiàn)114株豬鏈球菌中有106株屬于ST7型。王洪敏等［20］的研究表明廣東2005年的5株人源豬鏈球菌2型株菌中有3株屬于ST7型，2株屬于ST1型，其中ST7型與2005年四川疫情株相同，而病人的ST1型與香港地區(qū)發(fā)現(xiàn)的豬鏈球菌相同；這與四川省暴發(fā)的人間豬鏈疫情明顯不同，四川僅由單一的ST7型豬鏈球菌克隆引起。研究表明，ST7型刺激T細胞增殖和誘導致炎因子釋放的能力比歐洲流行株ST1型更強［21］。不難看出，MLST最大特點是不同的實驗室獲得的結(jié)果可以比較，易于統(tǒng)一、標準化，并可經(jīng)互聯(lián)網(wǎng)共享，現(xiàn)已有許多學者將該技術(shù)用于流行病學研究中［22］。

此研究中對分離到的豬鏈球菌2型菌株進行MLST分析發(fā)現(xiàn)22株菌分布在3個ST型別：11株（病人9株、病豬2株）屬于ST1型，10株（病人8株、病豬2株）屬于ST7型，1株來自病豬的豬鏈球菌2型屬于ST28型，其中ST1、ST7型為病人和病豬菌株所共有，均同屬于ST1克隆復合物，顯示兩者菌株間的親緣關(guān)系極近。ST28型為病豬所特有，病豬菌株的ST型別呈現(xiàn)多樣化，部分型別與病人菌株出現(xiàn)交叉。

［1］Lu LL，Li R，Zheng YL，etal．Virulence factors of Streptococcus suis type 2［J］．Chin J Health Lab Technol，2008，18（3）：570－572．（in Chinese）路玲玲，李蓉，鄭玉玲，等．2型豬鏈球菌毒力因子研究進展［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18（3）：570－572．

［2］Fang QM，Huang SQ，Yu FS，etal．Genetic analysis on the main virulence genes in the Fujian strain of Streptococcus suis type 2from slaughtered pigs［J］．Chin J Zoonoses，2010，26（1）：65－68．（in Chinese）方勤美，黃紹謙，俞伏松，等．豬鏈球菌2型福建分離株的主要毒力基因分析［J］．中國人獸共患病學報，2010，26（1）：65－68．

［3］GB／T 19915．2－2005．Methods for detection of Streptococcus suis type 2［S］．Beijing：General Administration of Quality Supervision，Inspection and Quarantine of the People＇s Republic of China，Standardization Administration of the People＇s Republic of China，2005．（in Chinese）GB／T 19915．2－2005，豬鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)程［S］．北京：中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、中國國家標準化管理委員會，2005．

［4］Samantha JK，James AL，Peter JH，etal．Development of a multilocus sequence typing scheme for the pig pathogen Streptococcus suis：identification of virulent clones and potential capsular serotype exchange［J］．J Clin Microbiol，2002，40（10）：3671－3680．DOI：10．1128／JCM．40．10．3671－3680．2002

［5］Hill JE，Gottschalk M，Brousseau R，etal．Biochemical analysis，cpn 60and 16SrDNA sequence data indicate that Streptococcus suis serotypes 32and 34，isolated from pigs，are Streptococcus orisratti［J］．Vet Microbiol，2005，107（1－2）：63－69．

［6］He JF，Kang M，Chen JD，etal．The epidemiological characteristics of cases of Streptococcus suis infection five cases of Guangdong Province［J］．Chin J Epidemiol，2006，10（10）：864．（in Chinese）何劍峰，康敏，陳經(jīng)雕，等．廣東省五例人感染豬鏈球菌病例流行特征分析［J］．中華流行病學雜志，2006，10（10）：864．

［7］Staats JJ，F(xiàn)eder I，Okwumabua O，etal．Streptococcus suis：past and present［J］．Vet Res Commun，1997，21：381－407．DOI：10．1023／A：1005870317757

［8］Smith HE，Damman M，Van der Velde J，etal．Identification and characterization of the cpslocus of Streptococcus suis serotype 2：the capsule protects against phagocytosis and is an important virulence factor［J］．Infect Immun，1999，67（4）：1750－1756．

［9］Zeng QY，Lu CP．Induced cell fusion and apoptosis of epithelial muramidase－released protein of Streptococcus suis type 2［J］．Acta Microbiologica Sinica，2003，43（3）：407－411．（in Chinese）曾巧英，陸承平．豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白誘導上皮細胞融合和凋亡［J］．微生物學報，2003，43（3）：407－411．

［10］Gao SQ，Lei LC，Han WY．Progress on major virulence factors of Streptococcus suis type 2［J］．Chin J Biologicals，2006，19（6）：657－659．（in Chinese）高尚慶，雷連成，韓文瑜．豬鏈球菌2型主要毒力因子研究進展［J］．中國生物制品學雜志，2006，19（6）：657－659．

［11］Wisselink HJ，Smith HE，Stockhofe－Zurwieden N．etal．Distribution of capsular types and production of muramidase reaseased protein （MRP）and extracellular factor （EF）of Streptococcus suis strains isolated from diseased pigs seven European countries［J］．Vet Microbiol，2000，74（3）：237－248．

［12］Norton PM，Rolph C，Ward PN，etal．Epithelial invasion and celllysis by virulent strains of Streptococcus suis is enhanced by the presence of suilysin［J］．FEMS Immunol Med Microbiol，1999，26（1）：25－35．

［13］Vecht U，Isselink HJ，Ellema MJ，etal．Identification of two proteins associated with virulence of Streptococcus suis type 2［J］．Infect Immun，1991，59（9）：3156－3162．

［14］Staats JJ，Plattner BL，Stewart GC，etal．Presence of the Streptococcus suis suilysin gene and expression of MRP and EF correlates with high virulence in Streptococcus suis type 2isolates［J］．Vet Microbiol，1999，70（3－4）：201－211．

［15］Okwumabua O，Persaud J，Reddy P．Cloning and characterization of the gene encoding the glutamate dehydrogenase of Streptococcus suis serotype 2［J］．Clin Diagn Lab Immunol，2001，8（2）：251－257．

［16］Zhao R，Sun JH，Lu CP．Distribution characteristics of the isolates of Streptococcus suis virulence factor［J］．J Shanghai Jiaotong Univ（Agri Sci），2006，24（6）：495－498．（in Chinese）趙冉，孫建和，陸承平．豬鏈球菌國內(nèi)分離株毒力因子的分布特征［J］．上海交通大學學報（農(nóng)業(yè)科學版），2006，24（6）：495－498．

［17］Liao YL，Zou QM．Progress in study of gene of pathogenic microorganisms of multilocus sequence typing［J］．Prog in Microbiol Immunol，2007，5（4）：65－68．（in Chinese）廖亞玲，鄒全明．病原微生物基因多位點序列分型的研究進展［J］．微生物免疫學進展，2007，5（4）：65－68．

［18］King SJ，Leigh JA，Heath PJ，etal．Development of a multilocus sequence typing scheme for the pig pathogen Streptococcus suis：identification of virulent clones and potential capsular serotype exchange［J］．J Clin Microbiol，2002，40（10）：3671－3680．DOI：10．1128／JCM．40．10．3671－3680．2002

［19］Princivalli MS，Palmieri C，Magi G．Genetic diversity of Streptococcus suis clinical isolates from pigs and humans in Italy（2003－2007）［J］．Euro Surveill，2009，14（33）：pii：19310．

［20］Wang HM，Ke CW，Pan WB，etal．MLST typing of Streptococcus suis isolated from clinical patients in Guangdong Province in 2005［J］．J South Med Univ，2008，28（8）：1438－1441，1445．（in Chinese）王洪敏，柯昌文，潘武濱，等．2005年廣東省臨床分離豬鏈球菌的 MLST分子分型研究［J］．南方醫(yī)科大學學報，2008，28（8）：1438－1441，1445．

［21］Ye C，Zheng H，Zhang J，etal．Clinical，experimental，and genomic differences between intermediately pathogenic，highly pathogenic，and epidemic Streptococcus suis［J］．Infect Dis，2009，199（1）：97－107．DOI：10．1086／594370

［22］Ye CY，Bai XM，Zhang J，etal．Spread of Streptococcus suis sequence type 7in China［J］．Emerg Infect Dis，2008，14（5）：787－791．DOI：10．3201／eid1405．070437