王鶴佳，劉智宏，金銀珍，汪 霞，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

克侖特羅(Clenbuterol)是一種β－受體激動劑，在臨床上用于防治支氣管哮喘以及哮喘型慢性支氣管炎、肺氣腫等疾病［1］。由于其能顯著降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率，曾在畜牧業(yè)上作為促生長劑而廣泛使用?？藖鎏亓_具有較大毒性，人們食用克侖特羅高殘留的動物性食品后，可導(dǎo)致心悸、頭痛、惡心、嘔吐、血管擴(kuò)張和肌肉震顫等中毒癥狀。農(nóng)業(yè)部176號公告規(guī)定，禁止在飼料和動物飲用水中使用克侖特羅［2］。農(nóng)業(yè)部193號公告規(guī)定克侖特羅禁用于所有食品動物的所有用途［3］。農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定，禁止使用克侖特羅及其鹽、酯，且在動物性食品中不得檢出［4］。

目前檢測動物性食品中克侖特羅殘留的確證方法主要為液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法。但由于需要昂貴的儀器設(shè)備，且前處理步驟復(fù)雜，成本較高，不利于基層單位的日常監(jiān)測和大規(guī)模篩查。而酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒可經(jīng)濟(jì)、快速地檢測動物性食品中的克侖特羅。實驗比較了市售18個廠家的試劑盒，用于豬尿中克侖特羅殘留檢測時，在可操作性、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等參數(shù)［5，6］上的差異，為了解國內(nèi)市場上克侖特羅酶聯(lián)免疫試劑盒的現(xiàn)狀提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料 不同來源豬尿樣品20份，采自陜西省和寧夏回族自治區(qū)屠宰場。市售18個廠家的克侖特羅ELISA試劑盒，每個廠家選擇一個批次的產(chǎn)品(產(chǎn)品代號為A－R)。鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品，純度98．5%，Dr．Ehrenstorfer EmbH 公司。

1．2 儀器 高速冷凍離心機(jī)，型號Ttettich;酶標(biāo)儀，型號Sunrise。

1．3 方法

1．3．1 試料的制備 空白試料 20份不同來源豬尿樣品經(jīng)液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［7］確證為不含β－受體激動劑的空白試料。

陽性添加試料 取經(jīng)儀器方法確證的空白試料，添加克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成濃度為1μg/L的陽性添加試料。按上述方法配制6個樣品。

1．3．2 檢測方法 樣品前處理方法 將空白試料和陽性添加試料分別于5000 r/min離心5 min，取上清液備用，按照試劑盒各自說明書要求對樣品進(jìn)行稀釋后測定或直接測定。

試劑盒操作步驟 按照試劑盒各自說明書進(jìn)行操作。

1．3．3 靈敏度 IC50測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到該標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50。IC50為50%抑制濃度即B/B0=50%時所對應(yīng)的濃度，用于衡量抗體靈敏度，IC50越低說明抗體的靈敏度越高。

檢測限 測定20份空白試料，計算測定值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。豬尿中克侖特羅的檢測限為平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差［8］。

1．3．4 準(zhǔn)確度和精密度 取6個陽性添加試料進(jìn)行測定，計算豬尿中克侖特羅的平均回收率和變異系數(shù)［8］。陽性添加回收率=實測濃度/添加濃度×100%。

2 結(jié)果

2．1 試劑盒可操作性 18個試劑盒中，15個產(chǎn)品都采用一步法，操作時間均在1 h左右，基本不需要樣品前處理步驟，可直接用于測定。結(jié)果見表1。

表1 操作步驟比較結(jié)果

續(xù)表

2．2 靈敏度 18個試劑盒的豬尿中克侖特羅檢測限范圍為 0．26 μg/L ～2．3 μg/L，IC50濃度范圍為0．25 μg/L～2．1 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為0～25 μg/L。結(jié)果見表2。

表2 試劑盒靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍(μg/L)

2．3 準(zhǔn)確度和精密度 18個試劑盒的豬尿中克侖特羅1μg/L濃度添加回收率范圍為61．0% ～378%，平均回收率范圍為78．8% ～321%，變異系數(shù)為2．4% ～18．3%。結(jié)果見表3。

表3 豬尿中克侖特羅1μg/L濃度添加回收率和變異系數(shù)(%)

續(xù)表

2．4 試劑盒綜合比較 18個試劑盒在檢測限、回收率、變異系數(shù)和操作時間等參數(shù)的綜合比較［8］，(評價參數(shù)指標(biāo)未說明)結(jié)果見表4。

表4 試劑盒綜合比較表

3 討論

3．1 靈敏度 市售的18個廠家試劑盒用于豬尿中克侖特羅殘留檢測的檢測限范圍為0．26μg/L～2．3μg/L。2012年農(nóng)業(yè)部《全國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全例行監(jiān)測方案》和《動物及動物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計劃》中規(guī)定豬尿中克侖特羅殘留的判定限均為1μg/L。作為篩選方法，目前市售試劑盒在豬尿中的檢測限大部分都能夠達(dá)到1μg/L，但有5個產(chǎn)品的檢測限大于1μg/L。

目前市售試劑盒標(biāo)稱的靈敏度多以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)溶液中的最低濃度表示，并非實際樣品的檢測限。此外，不同組織樣品的檢測限也有所不同，有些產(chǎn)品說明書中用同一數(shù)據(jù)覆蓋所有組織樣品，準(zhǔn)確性有待提高。

3．2 準(zhǔn)確度和精密度 市售的18個廠家試劑盒在豬尿中克侖特羅1μg/L濃度添加試驗中，平均回收率范圍為78．8% ～321%。豬尿基質(zhì)組成復(fù)雜，對酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果影響較大，回收率可有效反映試劑盒本身的抗干擾能力。實驗考察的18個廠家試劑盒中，9個廠家試劑盒的添加回收率在60% ～120%之間。

選取不同廠家試劑盒的一個批次的產(chǎn)品進(jìn)行試驗，計算得到的變異系數(shù)反映了試劑盒的批內(nèi)變異情況，變異系數(shù)范圍為2．4% ～18．3%。

3．3 操作便利性 市售18個廠家的試劑盒中，15個產(chǎn)品都采用一步法，其中大部分產(chǎn)品的操作時間都在1 h左右，尿樣不需要酶解等前處理步驟，可直接用于測定，便于日常監(jiān)測和大規(guī)模篩查。

3．4 綜合評價 近年來，國產(chǎn)克侖特羅酶聯(lián)免疫試劑盒質(zhì)量大幅提升，在靈敏度、準(zhǔn)確度等方面均可滿足目前的日常檢測需要。與此同時，試劑盒品種繁多，質(zhì)量良莠不齊，建議在選擇試劑盒前對其重要的性能參數(shù)進(jìn)行考察。

［1］ 張家銓，程 鵬．常用藥物手冊［M］．第4版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2011．

［2］ 農(nóng)業(yè)部176號公告．禁止在飼料和動物飲水中使用的藥物品種目錄［S］．

［3］ 農(nóng)業(yè)部193號公告．食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單［S］．

［4］ 農(nóng)業(yè)部235號公告．動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］．

［5］ Sabine Hahnau，Bernd Julicher．Evaluation of commercially available ELISA test kits for the detection of clenbuterol and otherβ2－agonists［J］．Food Additives and Contaminants，1996，13:259 －274．

［6］ 葉 妮，劉智宏，郭文林，等．國內(nèi)外克倫特羅ELISA檢測試劑盒評價［J］．中國獸藥雜志，2002，36(10):25 －28．

［7］ 農(nóng)業(yè)部1025號公告－18－2008．動物源性食品中β－受體激動劑殘留檢測液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［S］．

［8］ 農(nóng)醫(yī)發(fā)［2005］17號．關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案審查技術(shù)資料要求》和《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》的通知［S］．