華北八寶組織培養(yǎng)與再生體系的建立

張璐，王俊麗，王玨，田璧瑞，馬林喜

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

華北八寶（Hylotelephiumtatarinowii（Maxim.）H.Ohba），又稱華北景天，是景天科八寶屬的多年生草本植物.花期7～8月，果期9月.分布于內(nèi)蒙古、河北、山西等地，生于海拔1 000～3 000m處山地石縫中.常見于向陽山石上［1］.

華北八寶屬于中國(guó)的名貴香草植物，可用于精油香料的提取、疾病的防治等［2］.該植物為多肉多漿耐旱花卉，株型小巧，花朵繁茂，可作為耐旱盆栽花卉用于城市園林綠化，并且已被錄入中國(guó)第6批植物新品種保護(hù)名錄［3－4］.

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，八寶屬植物大多具有藥用價(jià)值，例如，八寶、輪葉八寶、珠芽八寶、白八寶、狹穗八寶、紫花八寶［5－6］等植物具有祛風(fēng)清熱、散瘀消腫、消炎止血等功效.由于華北八寶分布海拔較高，在低海拔地區(qū)繁殖難度大，目前可利用的野生資源較少.為了進(jìn)一步擴(kuò)大種源，可以采用組織培養(yǎng)的方法，建立華北八寶的快速高效再生體系.目前已有多種植物通過組織培養(yǎng)技術(shù)建立了其再生體系，如半夏［7］、新疆雪蓮［8］、胭脂花［9］等.

本研究的目的在于以野生華北八寶植株為材料，建立組織培養(yǎng)再生體系，為華北八寶的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料的選取與消毒處理

華北八寶野生植株采自北京靈山海拔2 300m的石縫間.選取其幼嫩葉片作為外植體，將幼嫩葉片小心取下，用洗滌靈清洗干凈之后在流水下沖洗2h，用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡30s，再浸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的HgCl2中（加吐溫2滴）消毒12min，用無菌水沖洗3～4次.

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖和1%的瓊脂粉（pH 5.8），121℃高壓滅菌20min.

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

在MS培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量濃度的2，4－D（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L）與6－BA（0，0.5，1.0，2.0mg／L）2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，以幼嫩葉片為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo).

將消毒后的幼嫩葉片切成0.3cm×0.5cm的小塊，并用刀片在葉面上刻傷，接種于已經(jīng)過121℃高壓滅菌20min后的培養(yǎng)基中，每瓶接種7塊，9瓶為一個(gè)處理，重復(fù)3次，30d后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率.

1.2.2 不定芽的分化誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的6－BA（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L），TDZ（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L），NAA（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L），以生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織為材料進(jìn)行不定芽的分化誘導(dǎo).

將愈傷組織切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊，每瓶接種7塊，9瓶為一個(gè)處理，重復(fù)3次，30d后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率.

1.2.3 生根培養(yǎng)

分別在MS，1／2MS 2種培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng).將長(zhǎng)到2～3cm的不定芽取出，接于增殖培養(yǎng)基6－BA 1.0mg／L中.20d后將長(zhǎng)到3～4cm的不定芽接于生根培養(yǎng)基中，每瓶接種數(shù)為6個(gè)，9瓶為一個(gè)處理，重復(fù)3次，30d后觀察統(tǒng)計(jì)生根率.

1.2.4 煉苗與移栽

選取已生根且植株健壯的再生苗，移栽前先打開瓶蓋，在散射光條件下煉苗3d，之后用鑷子輕輕取出幼苗，先將幼苗根部的培養(yǎng)基用清水沖洗干凈，然后將幼苗移栽到珍珠巖∶營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石＝1∶2∶1（體積比）的培養(yǎng)土中.移栽后澆透水，之后保持適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度和光?移栽15d后統(tǒng)計(jì)成活率.

1.2.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光照時(shí)間為12h／d，光照強(qiáng)度為40μmol／（m2·s）.

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加單一植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)效果均不好.當(dāng)2，4－D質(zhì)量濃度為2.0mg／L時(shí)誘導(dǎo)率最高為23.81%（表1）；6－BA質(zhì)量濃度為1.0mg／L時(shí)誘導(dǎo)率最高為12.56%（表2）.在含有不同質(zhì)量濃度2，4－D和6－BA組合的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率較高，以培養(yǎng)基MS＋2，4－D 2.0mg／L＋6－BA 0.5mg／L中的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了92.06%（表3），并且愈傷組織狀態(tài)良好，黃綠色較疏松，生長(zhǎng)旺盛（圖1）.

表1 2，4－D對(duì)華北八寶愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Tab.1 Effect of 2，4－D on induction rates of the callus of Hylotelephium tatarinowii

表2 6－BA對(duì)華北八寶愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Tab.2 Effect of 6－BA on induction rates of the callus of Hylotelephium tatarinowii

數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05，標(biāo)有相同字母的數(shù)據(jù)表示差異不顯著，標(biāo)有不同字母的數(shù)據(jù)表示差異顯著.

表3 6－BA和2，4－D組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Tab.3 Effects of different mass concentrations of 6－BA and 2，4－D on callus induction rates

圖1 2，4－D與6－BA配合對(duì)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)Fig.1 Effects of 2，4－D in combination with 6－BA on callus induction

2.2 不定芽的誘導(dǎo)

2.2.1 TDZ與6－BA組合對(duì)不定芽分化的影響

在含有不同質(zhì)量濃度的TDZ或不同質(zhì)量濃度配比的TDZ與6－BA組合的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，均未有不定芽的分化，部分愈傷組織呈現(xiàn)嫩綠色且有所增殖，部分愈傷組織褐化或死亡.因此這類培養(yǎng)基組合不適合華北八寶不定芽的分化培養(yǎng).

2.2.2 TDZ與NAA組合對(duì)不定芽分化的影響

在含有不同質(zhì)量濃度配比的TDZ與NAA的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，也均未有不定芽的分化，且未分化的愈傷組織部分褐變或死亡.因此這類培養(yǎng)基組合同樣不適合華北八寶不定芽的分化培養(yǎng).

2.2.3 6－BA與NAA組合對(duì)不定芽分化的影響

在含有不同質(zhì)量濃度的6－BA或不同質(zhì)量濃度配比的6－BA與NAA組合的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，均有不定芽的分化.愈傷組織在接入含6－BA與NAA的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，10d內(nèi)體積有所增大，顏色加深，15d后開始出現(xiàn)綠色小突起，20～25d時(shí)，部分愈傷組織開始叢生不定芽（圖2）.在MS＋6－BA 1.0mg／L培養(yǎng)基中不定芽的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到81.52%（表4）.

圖2 愈傷組織分化不定芽Fig.2 Adventitious bud induced from callus

表4 愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率Tab.4 Adventitious bud induction rates

2.3 生根培養(yǎng)

不定芽在MS和1／2MS 2種培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，10d后，開始生出白色細(xì)根，最長(zhǎng)可達(dá)到3～4cm，成輻射狀分布.培養(yǎng)30d后，2種培養(yǎng)基的生根率均可達(dá)到100%.1／2MS培養(yǎng)基中每個(gè)植株的平均根條數(shù)可達(dá)到5.9條，而MS培養(yǎng)基中的平均根條數(shù)為4.0條（圖3）.

圖3 再生苗Fig.3 Regenerated plants

2.4 煉苗與移栽

生根苗煉苗移栽后，植株生長(zhǎng)良好，15d后統(tǒng)計(jì)，移栽成活率可達(dá)95%以上.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中單獨(dú)附加2，4－D或6－BA，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果均不顯著，而質(zhì)量濃度低于4.0mg／L的2，4－D和6－BA配合使用時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯提高.在加入2，4－D和6－BA不同質(zhì)量濃度組合的培養(yǎng)基中，若2，4－D質(zhì)量濃度低于6－BA或與之相同時(shí)，葉片膨大表現(xiàn)得較為明顯，并且誘導(dǎo)出的愈傷組織為深綠色且較致密.而在2，4－D質(zhì)量濃度高于6－BA質(zhì)量濃度時(shí)，葉片膨大現(xiàn)象不明顯，誘導(dǎo)出的愈傷組織為淺黃綠色且較疏松.較高質(zhì)量濃度的2，4－D（4.0mg／L）不利于愈傷組織的誘導(dǎo).MS＋2，4－D 2.0mg／L＋6－BA 0.5mg／L培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了92.06%.王俊麗等［10］在對(duì)華北大黃愈傷組織誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不同質(zhì)量濃度的6－BA分別與低質(zhì)量濃度2，4－D配合使用時(shí)，對(duì)愈傷組織的增殖效應(yīng)十分明顯，其中MS＋6－BA 2.0mg／L＋2，4－D 0.2mg／L培養(yǎng)基的增殖效果較好，這與本研究的結(jié)果不盡相同.

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，6－BA是影響不定芽分化的關(guān)鍵因素，在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加不同質(zhì)量濃度的6－BA或不同質(zhì)量濃度配比的6－BA與NAA組合，均可誘導(dǎo)不定芽的分化.這與文獻(xiàn)所報(bào)道的細(xì)胞分裂素對(duì)組織培養(yǎng)中不定芽的分化及增殖有著顯著作用結(jié)論［11－12］相一致.張曉艷等［13］研究了影響八寶景天愈傷組織誘導(dǎo)、芽誘導(dǎo)、生根的主要因素，發(fā)現(xiàn)八寶景天葉片切塊誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS＋6－BA 2.0mg／L＋NAA 1.0mg／L，誘導(dǎo)率達(dá)93.3%；MS＋6－BA 2mg／L＋NAA 0.1mg／L培養(yǎng)基有利于芽的分化和增殖.任爽英等［14］研究也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加6－BA時(shí)對(duì)八寶景天不定芽的分化有促進(jìn)作用.上述研究與本研究結(jié)果相一致.

本研究以華北八寶幼嫩葉片為外植體建立了其組織培養(yǎng)再生體系，這對(duì)野生華北八寶的開發(fā)與利用有著重要意義.

［1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第34卷：第1分冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，1984：52.

［2] 黃德娟，黃德超.我國(guó)名貴香草植物及應(yīng)用價(jià)值研究［J］.北方園藝，2007（3）：80－82.HUANG Dejuan，HUANG Dechao.Research of China's rare vanillaplants and their application value［J］.Northern Horticulture，2007（3）：80－82.

［3] 王建國(guó).遼寧農(nóng)業(yè)植物新品種保護(hù)工作成效及發(fā)展建議［J］.雜糧作物，2006，26（3）：254－封三.WANG Jianguo.Suggestions on the protection effectiveness of new varieties of agricultural plants in Liaoning［J］.Rain Fed Crops，2006，26（3）：254－coverⅢ.

［4] 熊敏瑞.植物新品種保護(hù)與農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12（2）：155－156，158.XIONG Minrui.Protection of new plant varieties and the development of rural economic［J］.Journal of Hebei Agricultural Sciences，2008，12（2）：155－156，158.

［5] 鄭艷，錢嘯虎，姚勝.安徽景天科Crassulaceae植物的分類研究［J］.安徽師大學(xué)報(bào)；自然科學(xué)版，1994，17（4）：69－75.ZHENG Yan，QIAN Xiaohu，YAO Sheng.Research on the Taxonomy of Crassulaceae in Anhui Province［J］.Journal of Anhui Normal University：Natural Science，1994，17（4）：69－75.

［6] 孫元發(fā)，王志剛.黑龍江省的野生景天科植物及其價(jià)值［J］.林業(yè)科技情報(bào)，2004，36（2）：4－7.SUN Yuanfa，WANG Zhigang.Wild orpine and their value in heilongjiang province［J］.Forestry Science and Technology Information，2004，36（2）：4－7.

［7] WANG Junli，WANG Qian，WANG Jue，et al.Effect of different plant growth regulators on micro－tuber induction and plant regeneration ofPinelliaternate（Thunb）Briet［J］.Physiology and Molecular Biology of Plants，2009，15（4）：359－365.

［8] GUO Bin，GAO Min，LIU Chunzhao.In vitro propagation of an endangered medicinal plantSaussureainvolucrataKar.et Kir［J］.Plant Cell Rep，2007（26）：261－265.

［9] 宋韻霏，王俊麗，畢凱麗，等.胭脂花的組織培養(yǎng)與植株再生［J］.河北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，32（6）：630－634.SONG Yunfei，WANG Junli，BI Kaili，et al.Tissue culture and plant regeneration ofPrimulamaximowiczii［J］.Jornal of Hebei University：Natural Science Edition，2012，32（6）：630－634.

［10] 王俊麗，陸遠(yuǎn)，劉坤，等.華北大黃愈傷組織培養(yǎng)及土大黃苷含量研究［J］.河北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，31（2）：195－199 WANG Junli，LU Yuan，LIU Kun，et al.Callus proliferation and rhaponticin accumulation ofRheumfranzenbachiiMunt［J］.Jornal of Hebei University：Natural Science Edition，2011，31（2）：195－199

［11] 田士林，李莉.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織形成和根芽分化的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（14）：4132，4179.TIAN Shilin，LI Li.Influences of plant growth regulations on differentiation of plant callus and buds［J］.Journal of Anhui Agricultural Science，2007，35（14）：4132，4179.

［12] WANG G Y，YUAN M F，HONG Y.In vitro flower induction in roses［J］.In Vitro Cell Dev Biol－Plant，2002，38：513－518.

［13] 張曉艷，程云清.八寶景天的組織培養(yǎng)與快速繁殖［J］.吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007（2）：60－62.ZHANG Xiaoyan，CHENG Yunqing.Tissue culture and rapid propagation ofSedumspectabileBoreau［J］.Journal of Jilin Normal University：Natural Science Edition，2007（2）：60－62.

［14] 任爽英，董麗.八寶景天的組織培養(yǎng)和快速繁殖［J］.植物生理學(xué)通訊，2006，42（2）：246.REN Shuangying，DONG Li.Tissue culture and rapid propagation ofSedumspectabile‘Star Dust’［J］.Plant Physiology Journal，2006，42（2）：246.