NMNAT1基因?qū)w外原代培養(yǎng)神經(jīng)元樹突發(fā)育的影響

趙 虹 張驚宇 車守梅 赫丹丹 郭朝暉

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 哈爾濱 150001

1 材料與方法

1.1動物和藥物原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元來源于ICR小鼠（SLAC.CHINA）的胚胎，動物實驗保護協(xié)議由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院動物倫理委員會批準。酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑FK－866購置于美國cayman化學(xué)制品公司。

1.2試驗方法

1.2.1 DNA構(gòu)建：編碼小鼠NMNAT1基因的cDNA從小鼠腦cDNA庫中經(jīng)PCR擴增得到的，所用引物：5′－ATGGACTCATCCAAGAAGACAGA－3′和 5－TCACAGAGTGGAGTGGAATGGTTGTGCTTG－3′，并克隆到 PIRES2－EGFP載體（Invitrogen公司）中產(chǎn)生野生型過表達NMNAT1（NMNAT1－OE）序列。

1.2.2 shRNA plasmids的生成：專門針對小鼠NMNAT1 mRNA三個非重疊序列設(shè)計后構(gòu)建到H1啟動子RNAi載體上（psuper，Oligoengine，USA）。最有效的19－核苷酸靶序列 是 5′－ACGAGTGGATCACCAATGA－3′（KD－shRNA）。非特異性對照寡核苷酸設(shè)立為無關(guān)序列作為對照，該序列為：5′－TTCTCCGAACGTGTCACGT－3′（Scr－shRNA），含 干擾序列的寡核苷酸在DNA合成過程中，末端引入BgLⅡ和XhoⅠ酶切位點。所有序列均被測序證實正確。

1.2.3 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：原代新皮層神經(jīng)元來源于剛出生小鼠（PO小鼠）的胚胎，簡而言之，分離新皮層組織，在4℃含6%葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中清洗2次，然后0.3%胰蛋白酶中37℃消化10min，并在補充B27添加劑（Invitrogen）0.5mmol／L、左旋谷氨酸和20mmol／L HEPES的無血清培養(yǎng)基中輕輕磨碎分離，pH 7.4，在體外培養(yǎng)3～6 d后，神經(jīng)元用于形態(tài)學(xué)實驗研究。培養(yǎng)的神經(jīng)元通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)染。簡單地說，一個包含有質(zhì)粒、電穿孔緩沖物和神經(jīng)元的混合物移到一個的容器中，用轉(zhuǎn)染試劑盒按程序通過電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染。

1.2.4 免疫印記分析：神經(jīng)元溶解在細胞溶解緩沖液中（10mmol／L Tris－HCL、5mmol／L EDTA、140mmol／L NaCl、0.2%聚乙二醇辛基苯基醚），包含蛋白酶抑制劑的混合物中1h，1 300r離心10min，以合適的SDS－PAGE膠進行蛋白電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF（Millipore）膜上，用封閉液稀釋一抗，將已封閉的膜置于一抗溶液中4℃過夜，然后放入用辣根過氧化物酶標記的二抗中孵化（1∶5000，Jackson Immuno Research），細胞膜用熒光檢測試劑（GE，USA）檢測，小鼠的單克隆抗體和小鼠的抗－action抗體，分別來自于Santacruz（sc－30842）和Chemicon（MAB1501）。

1.2.5 免疫細胞化學(xué)：細胞固定于含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS緩沖液中，用5%BSA 和0.2%Ttriton－100在PBS緩沖液中封閉和透化后，細胞在一抗中4℃孵化一夜，然后細胞用Alexa488和Alexa568共軛二抗在室溫下清洗孵化1h。小鼠單克隆抗－Taul（MAB2239）和小鼠單克隆抗體Map2（AB5622）購置于Chemicon。

1.2.6 成像和圖像分析：膠片在熒光顯微鏡下掃描（尼康，日本）。分析神經(jīng)突的延長和分支，關(guān)鍵是能夠成像一個單一神經(jīng)元的全部過程，并能區(qū)別它們是軸突還是樹突，對成像軸突，需要使用相對低功率放大（20×）獲得圖像，包括神經(jīng)元的成像。對成像的樹突分支（40×）物象提供最優(yōu)放大。被轉(zhuǎn)染的細胞用綠色熒光GFP和樹突特異性標記MAP2免疫雙標神經(jīng)元樹突，Neurolucida軟件用來分析樹突的生長，并計算樹突的長度。

1.3統(tǒng)計分析計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，樹突的復(fù)雜度通過計算從神經(jīng)元發(fā)出的主要樹突的分支點計算，分析得到的數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件Prism 5.0進行統(tǒng)計分析，組間比較采用one－way ANOVE（方差分析）及post－h(huán)oct－test方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠NMNAT1shRNA和過表達載體在培養(yǎng)的神經(jīng)元中有效構(gòu)建為研究NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能，我們設(shè)計了一個針對小鼠NMNAT1mRNA的shRNA結(jié)構(gòu)（NMNAT1KD－shRNA），我們也設(shè)計了無針對性對照的shRNA（NMNAT1Scr－shRNA），我們把每個shRNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，檢驗敲除內(nèi)源性NMNAT1蛋白的能力，Western－blotting分 析顯 示過 表達 NMNAT1（NMNAT1－OE）高表達 NMNAT1而 KD－shRNA 有效敲除了NMNAT1基因（圖1A和1B），而Scr－shRNA未影響到NMNAT1表達。這些結(jié)果證明小鼠NMNAT1過表達和干擾慢病毒載體構(gòu)建在原代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)元中是有效的。

2.2 NMNAT1在培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)元中調(diào)控樹突的形態(tài)以前的研究顯示NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域廣泛表達，我們假定NMNAT1可能在神經(jīng)元形態(tài)方面起一定作用，為探索NMNAT1對樹突形態(tài)的作用，我們用NMNAT1過表達和NMNAT1干擾的慢病毒載體轉(zhuǎn)染了DIV0的神經(jīng)元，在DIV6用GFP和樹突特異標記MAP2免疫雙標這些細胞。我們發(fā)現(xiàn)過表達NMNAT1（NMNAT1－OE）能夠增加樹突分支的數(shù)量和整個樹突的總長度。相反，NMNAT1KD－shRNA損害了樹突的生長，因為引起樹突分支和總長度的減少（圖2A和2B）。煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶是NAD合成途徑中的限速酶，過表達煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶能在體外顯示較強的軸突保護功能。為證明我們實驗性的形態(tài)學(xué)系統(tǒng)的完整性，一個高度特定的煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑，與以前下調(diào)NMNAT1的數(shù)據(jù)一致，在體外2nmol／L的FK－866抑制了樹突形態(tài)的發(fā)育（圖2A和2B）。總之，這些結(jié)果顯示在皮層神經(jīng)元NMNAT1和樹突的發(fā)育密切相關(guān)，它能夠在皮層神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的早期促進樹突的發(fā)育。

3 討論

最近的研究發(fā)現(xiàn)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）合成酶煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶1（NMNAT1）能夠影響小鼠和果蠅的軸突Wallerian＇s變性。NMNAT1能保護神經(jīng)元變性。然而NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中的作用還不十分清楚，是否影響樹突的發(fā)生也不清楚。NMNAT催化NAD的合成［1－2］。NAD在所有活細胞的新陳代謝中起關(guān)鍵作用，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為輔酶參與大量轉(zhuǎn)移反應(yīng)［3］，NMNAT1在 NAD 合成途徑中是主要酶［4］，NMNAT1顯示廣泛分布在被檢組織中，包括腦組織的各個亞區(qū)［5］。因此，尋找NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用很重要。

本研究我們研究了在體外NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元早期發(fā)育階段對神經(jīng)元形樹突發(fā)育的影響。我們發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染了Scr－shRAN的神經(jīng)元比較，NMNAT1KD－shRNA引起了樹突分支的顯著減少以及總長度的減少。且過表達NMNAT1促進了樹突的生長，這和過去報道的培養(yǎng)的脊髓背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元相一致［6］。我們的數(shù)據(jù)表明NMNAT1在大腦中高水平表達，在體外培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中參與促進軸突和樹突生長和復(fù)雜度的形態(tài)變化?？傊?，我們揭示了NMNAT1在神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)退行性疾病中的一個重要作用。

樹突異常和神經(jīng)退行性疾病的病理特征一致。目前，大多數(shù)的研究集中于神經(jīng)退行性疾病的遺傳綜合征，因為它們提供了可能了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)樹突異常的病因機制［7］。

一項在果蠅的研究表明NMNAT1是作為一個伴護蛋白而起作用［8］，關(guān)于 Wallerian＇s變性的幾項研究顯示，NMNAT1的NAD合成活動需要它對軸突的保護作用［9－13］，然而對于中樞神經(jīng)元樹突是否有保護作用，尤其是神經(jīng)元經(jīng)歷變性的過程時NMNAT1是否作為一個保護蛋白或酶而發(fā)揮功能知道的很少。因此，在不同的變性過程中，NMNAT1的不同功能特征將幫助我們理解它在神經(jīng)退行性疾病中的作用。據(jù)我們所知，我們的結(jié)論是第一次展示了NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)樹突生長和成熟中所起的作用。這里關(guān)于樹突形態(tài)異常與神經(jīng)變性的發(fā)現(xiàn)以及以往的關(guān)于軸突異常與神經(jīng)變性的關(guān)系支持這樣的觀點：NMNAT1失活在神經(jīng)元發(fā)育的早期關(guān)鍵階段影響軸突和樹突形態(tài)發(fā)育，因此導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退化，然而，NMNAT1對神經(jīng)形態(tài)和變性的影響機制還有待了解。

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