王芳妹,楊子劍,韓 梅,胡 翔,丁小鳳*
(1.湖南師范大學生命科學學院,蛋白質化學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室,中國長沙 410081;2.湖南省產商品質量監(jiān)督檢驗研究院,中國長沙 410007)
慢性粒細胞白血病(CML)是一種骨髓造血干細胞惡性增殖的造血系統(tǒng)腫瘤,約占全部白血病的20%左右.90%以上的慢性粒細胞白血病具有Ph染色體和BCR-ABL染色體易位融合基因的表達,主要表現(xiàn)為白細胞持續(xù)升高和脾臟顯著腫大[1].CML的病程可分為慢性期、加速期和急變期.目前可能徹底治療慢性粒細胞白血病的方法是移植造血干細胞,但是可供者來源有限[2].常規(guī)化學藥物和生物制劑IFN治療的不良反應大.近年來,分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼為數(shù)萬例CML患者顯著延長早慢性期和IFN-α治療失敗的晚慢性期.但伊馬替尼對于未分化的白血病干細胞無效,容易導致疾病復發(fā)且持續(xù)治療費用高[3-4].
阿司匹林是一種非甾體抗炎藥,主要用于解熱鎮(zhèn)痛、抗炎和抗血小板凝集,預防冠心病、中風等心腦血管疾病發(fā)作.近來研究發(fā)現(xiàn)長期小劑量服用阿司匹林可以降低多種癌癥的發(fā)病率[5].阿司匹林顯著抑制結腸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的生長,促進細胞凋亡[6-9].動物實驗證明阿司匹林可以使人結腸腫瘤縮小到15%,而沒有任何副作用[10].阿司匹林對慢性粒細胞白血病的治療研究卻少有報道.本研究探討阿司匹林對人慢性粒細胞白血病K562細胞株的抑制作用,并初步分析可能的分子機制,為白血病的臨床治療提供新的實驗依據(jù).
慢性粒細胞白血病K562細胞株為本實驗室保存.3~4周BALb/c品系雌性裸鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物公司.DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購于GIBCO公司.四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Hoechst 33258和阿司匹林購于Sigma公司,蛋白質分子質量標準購自 Fermentas公司.鼠抗 β-catenin、STAT5A、PARP、NF-κB p65和p21單克隆抗體購于Santa Cruz公司,鼠抗GAPDH單克隆抗體購于湖南遠泰生物公司.Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒購于美國BD公司.SuperSignal ECL發(fā)光試劑盒購于Pierce公司.其他常規(guī)試劑均購于上海生工公司.
人慢性粒細胞白血病K562半懸浮細胞培養(yǎng)于含10%(體積分數(shù))胎牛血清、1.667 mkat/L(即105U/L)青霉素、1.667 mkat/L(即105U/L)鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃含體積分數(shù)為5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).
分別用0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理的K562細胞培養(yǎng)36 h后,用普通光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照.將余下的細胞離心收集于1.5 mL離心管,加入0.5 mL多聚甲醛(40 g/L),緩緩懸起細胞,固定10 min.用PBS洗2遍.將細胞滴加至載玻片上,盡量使細胞分布均勻.稍晾干,均勻滴上0.5 mL Hoechst 33258染色液,染色5 min.用PBS洗2遍.蓋上蓋玻片,用熒光顯微鏡觀察細胞核.每組實驗重復3次.
1.4.1 MTT法 K562細胞在24孔板上培養(yǎng)至對數(shù)生長期,分別加入適當?shù)乃幬锾幚?4 h和48 h.加入50 μL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)3~4 h后,離心,棄上清,加入二甲基亞砜200 μL,水平漩渦器振蕩使結晶完全溶解,測定每孔波長490 nm的吸光值.每組實驗設3個復孔,實驗重復3次.
1.4.2 細胞計數(shù)法 將1×109個/L的K562細胞接種6孔板中,分別加入0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理24 h和48 h.將細胞用臺盼藍溶液染色,用計數(shù)板于低倍顯微鏡下計算各組細胞的密度.每組實驗設3個復孔,實驗重復3次.
1.4.3 軟瓊脂克隆形成實驗 K562細胞經0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理24 h并加入含體積分數(shù)為10%FBS的DMEM的0.35%瓊脂培養(yǎng)基,每孔2 000個細胞,共設3個平行組,輕輕轉動6孔板使細胞分散均勻.置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d.在低倍顯微鏡下計數(shù)大于30個細胞的克隆數(shù),數(shù)碼相機拍照.每組至少重復3次實驗.
K562細胞經0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理36 h,收集細胞(每組至少1×106個細胞),采用Annexin V-FITC/PI染色后上機操作,以未染色細胞進行機器調零,分別以Annexin V-FITC和PI單染管作為基準參照,測定每組細胞的數(shù)據(jù),顯示凋亡細胞的百分比.每組至少重復3次實驗.
將1×107個細胞接種于8只BALb/c裸鼠背部皮下,接種后每天觀察荷瘤小鼠的生長情況,當瘤體長到1 cm3左右,選取4只瘤體體積相同的裸鼠進行腹腔注射給藥,實驗組給予25 mg/kg的阿司匹林,對照組給予0.1 mL生理鹽水,各組每兩天測瘤體體積和給藥1次,連續(xù)2周.末次給藥24 h后以脫臼法將裸鼠處死,取出皮下移植瘤,稱重和拍照.每組實驗重復2次.
收集0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理K562細胞36 h的蛋白裂解物,SDS-PAGE電泳后,電轉移至PVDF膜上,置于5 mL含脫脂奶粉50 g/L的TBS緩沖液中封閉1 h.加入一抗(1∶1 000稀釋),37℃孵育2 h,TTBS洗膜,5 min×4次.加入羊抗鼠二抗(1∶2 000稀釋),37 ℃孵育45 min,TTBS洗膜,5 min×4 次,ECL顯色,拍照分析.
應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,實驗組與對照組樣本進行均數(shù)比較的t檢驗.以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.
顯微鏡下可見正常K562細胞呈圓形或卵圓形,細胞飽滿,大小不規(guī)則;而經10 mmol/L阿司匹林處理后的K562細胞形態(tài)改變不明顯.當阿司匹林的濃度達到20 mmol/L時細胞變小,變圓形,細胞崩解成許多碎片,細胞數(shù)目明顯減少.尤其經過30 mmol/L阿司匹林處理的細胞懸浮脫落,可見較多死細胞(圖1A).Hoechst 33258染色結果顯示阿司匹林處理后的K562細胞核內可見致密的藍色熒光,核固縮出現(xiàn),并呈阿司匹林濃度依賴性(圖1B).結果表明,阿司匹林促進K562細胞的凋亡.
圖1 細胞形態(tài)學觀察不同濃度阿司匹林對K562細胞的影響(A:光學顯微鏡下觀察;B:Hoechst 33258染色觀察)Fig.1 Effects of different concentrations of aspirin on the morphology of K562 cells(A:An optical microscopic observation;B:Hoechst 33258 staining observation)
采用不同濃度的阿司匹林處理K562細胞,MTT法測定結果顯示隨著阿司匹林濃度的增大和作用時間的延長,K562細胞的存活數(shù)顯著下降.阿司匹林處理24 h后細胞大多數(shù)凋亡,48 h后細胞基本都已死亡.與對照組相比,實驗組的細胞增殖活性在24 h和48 h明顯降低,具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2A).
細胞計數(shù)法結果顯示10 mmol/L阿司匹林處理24 h后細胞數(shù)目呈減少趨勢,與0 mmol/L阿司匹林對照組相比細胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);20和30 mmol/L阿司匹林處理24 h后細胞數(shù)目明顯低于對照組(P<0.05).阿司匹林處理48 h后K562細胞數(shù)目隨著阿司匹林濃度的增大和作用時間的延長迅速下降(P<0.01)(圖2B).軟瓊脂克隆形成實驗也發(fā)現(xiàn)隨著阿司匹林濃度的增大K562細胞的克隆形成能力急劇下降.阿司匹林各濃度與對照組相比差異都很顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2C).
圖2 細胞增殖分析阿司匹林對K562細胞的影響A:MTT法檢測不同濃度的阿司匹林處理K562細胞后的抑制曲線;B:細胞計數(shù)法檢測不同濃度的阿司匹林處理K562細胞后的細胞數(shù)目變化;C:軟瓊脂克隆形成實驗檢測不同濃度的阿司匹林處理K562細胞后的克隆數(shù),內置圖是集落細胞的放大(*P<0.05;**P<0.01).Fig.2 Effects of aspirin on the proliferation of K562 cellsA:MTT assays of K562 cells treated with different concentrations of aspirin.B:Cell counting assay of treated K562 cells.C:Soft agar colony formation assay of K562 cells treated with aspirin.The inset shows the amplification of colony cells.*P <0.05;**P <0.01.
K562細胞用阿司匹林處理36 h后以流式細胞儀進行分析,結果表明K562的晚期凋亡及凋亡后死亡數(shù)量隨著阿司匹林濃度的增加而增加,而相應的存活細胞呈現(xiàn)明顯的下降趨勢.尤其K562細胞在30 mmol/L的阿司匹林作用下,早期凋亡細胞所占比例為(11.71±4.84)%,晚期凋亡和死亡細胞所占比例為(58.01±5.19)%.濃度為20 mmol/L和30 mmol/L的阿司匹林組與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而10 mmol/L的阿司匹林組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)(表1).
表1 流式細胞儀檢測阿司匹林對K562細胞凋亡的影響Tab.1 Effects of aspirin on K562 cell apoptosis detected by FACS
裸鼠體內實驗觀察可見,腹腔注射阿司匹林后裸鼠的腫瘤生長明顯減慢,瘤組織上的血管較少,腫瘤的抑制率為37% ~42%(圖3A).與生理鹽水對照組相比腫瘤的質量和體積差異顯著,有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖3B-3D).這些結果提示阿司匹林對K562細胞株在裸鼠中的成瘤有明顯的抑制作用.
提取正常對照組和阿司匹林處理實驗組細胞的總蛋白,進行Western印跡分析細胞信號通道蛋白的表達量變化.結果顯示,以GAPDH蛋白表達量為內參,隨著阿司匹林濃度的增加Wnt信號通道的關鍵因子βcatenin的蛋白表達量逐漸降低,而細胞周期抑制因子p21蛋白表達明顯增高.同時信號傳導與轉錄激活因子5A(STAT5A)的蛋白水平下降;細胞內DNA修復系統(tǒng)的重要成員多聚ADP核糖聚合酶(PARP)表達下調;核轉錄因子-κB p65基因的表達降低(圖4).由此可見,阿司匹林可能影響Wnt、STAT、NF-κB信號通道和細胞周期的進程,進而抑制慢性粒細胞白血病細胞的生長和增殖.
圖3 裸鼠成瘤實驗(A:全身圖;B:腫瘤圖;C:腫瘤質量比較;D:腫瘤體積變化)Fig.3 Effect of aspirin on the in vivo tumorigenesis of K562 cells in nude mice(A:the whole-body images;B:the tumor image;C:the tumor weight measurement;D:the tumor volume measurement)
圖4 阿司匹林對細胞信號通道蛋白的表達影響Fig.4 Effects of aspirin on the protein levels of cell signaling pathways
阿司匹林是醫(yī)學史上的經典藥物,也是應用最廣泛的藥物.近來發(fā)現(xiàn)阿司匹林可以降低癌癥的發(fā)病風險和遠處轉移風險[5].阿司匹林在體內外對多種體內致癌物誘發(fā)性和移植性腫瘤均有明顯的抑制作用,而且腹腔注射阿司匹林對小鼠等均有顯著抗腫瘤的作用[6-9].血栓可促進癌細胞的轉移,阿司匹林對抗腫瘤轉移和擴散可能跟阿司匹林預防和破壞腫瘤細胞周圍的血栓從而防止癌細胞轉移有關[11].因而阿司匹林是一種很好的腫瘤化學預防劑[12-13].
白血病是起源于骨髓的惡性腫瘤,傳統(tǒng)的化療毒副作用大,易復發(fā),高耐藥性.作者的研究證實阿司匹林能夠體外促進慢性粒細胞白血病K562細胞凋亡性死亡,具有明顯的細胞形態(tài)和細胞數(shù)目變化,而且存在濃度和作用時間的依賴性.采用Annexin V-FITC/PI標記流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)30 mmol/L濃度的阿司匹林對K562細胞誘導凋亡作用最明顯,細胞毒性作用最強.裸鼠成瘤實驗也顯示阿司匹林能有效抑制人K562裸鼠移植瘤的生長,實驗組的腫瘤體積和質量明顯低于對照組,抑瘤率為37% ~42%.本實驗未發(fā)現(xiàn)有腫瘤轉移,這可能與K562細胞在裸鼠中轉移潛能低有關.阿司匹林能否抑制K562轉移和擴散,需用不同的實驗模型進行進一步的研究.總之,這些結果提示阿司匹林可能具有一定的治療慢性粒細胞白血病的效果.
近年來的研究表明阿司匹林抗癌的機制有下調抑制凋亡bcl-2基因的活性,上調促進凋亡的bax基因表達,促進細胞凋亡[14];抑制NF-κB活性導致細胞生長停滯[15];抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)蛋白的表達從而抑制炎癥和細胞分裂或降低前列腺素的合成而發(fā)揮抗腫瘤效應[16];誘導自殺相關因子Fas表達,下調Fas配體(FasL)表達,通過 Fas-FasL途徑誘導腫瘤細胞的免疫殺傷[17].本實驗提示阿司匹林降低了 β-catenin、STAT5A、PARP和NF-κB p65在K562細胞中的蛋白表達,而細胞周期抑制因子p21蛋白的表達增高.β-catenin是Wnt信號通道的關鍵蛋白,調節(jié)了癌細胞的增殖、分化和轉移[18].STAT通道持續(xù)激活可導致細胞異常增殖和惡性轉化,目前發(fā)現(xiàn)STAT5A缺失可抑制癌細胞的存活率和延緩小鼠模型上乳腺癌的進展,提示降低STAT5A的活性可能是乳腺癌治療的有效途徑[19].PARP主要在細胞過程如DNA修復和程序化細胞死亡中起作用,有研究表明PARP抑制劑引起DNA修復缺陷,這是腫瘤治療的一類新藥[20].轉錄因子NF-κB p65與腫瘤轉化、侵襲、轉移、凋亡抵抗等密切相關,小干擾RNA沉默NF-κB p65基因表達可抑制胰腺癌細胞株PANC-1增殖并誘導其凋亡[21].p21是一個抑癌基因,與細胞周期蛋白及其激酶復合物結合抑制Rb蛋白質的磷酸化而調節(jié)轉錄因子E2F的活性,從而阻止細胞周期從G1過渡到S期,抑制細胞增殖.并且p21的低表達與多數(shù)腫瘤的預后不良密切相關[22].這些提示阿司匹林影響慢性粒細胞白血病中的Wnt、STAT、NF-κB信號通道和阻滯細胞周期進程,其具體作用機制及其細胞信號途徑有待更深入的研究.由此可見,阿司匹林對慢性粒細胞白血病的治療具有重要的應用和開發(fā)前景.
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