趙 艷，胡桂萍，宋鳳琴，陳李林，尤民生*福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所，福建福州35000;>農(nóng)業(yè)部閩臺作物有害生物綜合治理重點實驗室，福建福州35000

鐵觀音是我國重要的茶品種，主要種植區(qū)為福建安溪地區(qū)，主要適生于亞熱帶酸性土壤。已有研究表明，由于茶園多為單一化種植，隨著植茶年限的增加，茶園土壤pH值明顯下降，Ca、Mg等鹽離子和微量元素相對缺乏，而Al、F和多酚類物質(zhì)逐漸在茶園土壤中富集和積累，從而形成特有的茶園土壤微生態(tài)環(huán)境，包括微生物群落結(jié)構(gòu)及土壤酶體系，土壤微生物呼吸作用等(Shi et al.，1999;Tachibana et al.，1995)。早在1985年，洪楨瑞等研究發(fā)現(xiàn)，茶樹根際環(huán)境里有多種類群微生物，包括一些對增進土壤肥力有顯著效益的種群，如固氮細菌、氮化細菌、纖維分解細菌等，且根際細菌群中以簡單氨基酸類物質(zhì)為養(yǎng)料的細菌占有很高比例，主要為假單孢菌屬Pseudomonas、短桿菌屬Brevibacterium、土壤桿菌屬Agrobacterium和微球菌屬Micrococcus等屬的細菌(洪禎瑞等，1985)。近年來，茶園土壤中固氮菌類等功能性微生物已有比較深入的研究。胡磊(2010)采用nifH基因?qū)μ追N圓葉決明的茶園根際土壤進行PCR-RFLP分析，發(fā)現(xiàn)土壤中的固氮微生物群落結(jié)構(gòu)豐富，主要為 α-、β-、γ-變形菌門及藍細菌門。目前，對于茶園根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究報道較少，鄭雪芳等(2010)分析得到不同海拔茶園土壤微生物磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)組成差異大，且微生物群落PLFA組成與海拔具有相關(guān)性。

根際土壤微生物是一個復(fù)雜的群體，隨著種植物的生長，會形成特有的根際微生物群落。根際土壤中存在的微生物具有一定的生理活性和功能多樣性，能促進植物根部生長和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，其群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性與植物的生長相輔相成(鄭雪芳等，2010)。大量研究表明，根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對于植物的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的貢獻(林生等，2012)。研究茶園生境條件下根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，對于闡明茶園根際土壤微生物學(xué)特點和確立健康茶園土壤微生物學(xué)指標有重要意義。本試驗通過變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)分析鐵觀音種植區(qū)不同海拔茶園根際土壤微生物中細菌的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分析不同海拔茶園根際土壤微生物中細菌群落的多樣性，利用生態(tài)學(xué)統(tǒng)計軟件Canoco(Braak，1988)對安溪茶園根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境變量中的土壤理化性質(zhì)進行蒙特卡羅檢驗(Monte Carlo Test)(Robert et al.，1999)，對影響茶園根際土壤細菌群落組成的環(huán)境因子進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)(van den Wollenberg，1977)，獲得茶園根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)、分布特征及影響其分布的環(huán)境因子和主環(huán)境因子，進一步明確鐵觀音生長的微生態(tài)特點，為鐵觀音的健康生長和管理提供微觀理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

2011年7月14～15日，于福建省泉州市安溪縣西坪鎮(zhèn)上堯村、感德鎮(zhèn)兩地，采用GPS定位，分別從海拔200～760 m分梯度采集茶園根際土壤，共15處茶園(附表1)。以茶樹主莖為中心，在半徑20～30 cm的范圍內(nèi)取土，去掉茶樹根部表面土層，采集0～20 cm土壤。以5點取樣法對各茶園根際土壤進行隨機采樣，然后將其混合到一個采集袋內(nèi)，帶回實驗室，置于4℃冰箱中保存。取500 g用于DGGE試驗，其余500 g送至福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料所進行土壤理化性質(zhì)檢測(附表2)。

1.2 研究方法

1.2.1 茶園根際土壤總 DNA的提取 采用Fast DNA? SPIN Kit for Soil試劑盒進行提取，500 mg土樣加入到Lysing matrix管中，按Mahmoudi的步驟進行提取(Araya et al.，2006)。

1.2.2 茶園根際土壤DNA的PCR擴增 采用16S通用引物8F和1492R(Ercolini，2004)進行PCR擴增，得到細菌16S片段之后，再用V3區(qū)引物R534和F341-GC(許愛清等，2010)對細菌V3區(qū)進行擴增。所用引物序列見表1，反應(yīng)體系如下:(1)16S rDNA的PCR擴增體系:引物8F(10 pmol·μL-1)1 μL，引物 1492R(10 pmol·μL-1)1 μL，土壤總DNA 1 μL，Taq PCR Mastermix(天根生化科技有限公司，下同)12.5 μL(1 ×)，ddH2O，總體積25 μL。(2)V3區(qū)的PCR擴增體系:引物R534(10 pmol·μL-1)1 μL，引物 F341-GC(10 pmol·μL-1)1 μL，DNA 模板 1 μL，Taq PCR Mastermix 12.5 μL(1 × )，ddH2O，總體積25 μL。

表1 用于PCR擴增的引物Table 1 Primers for PCR amplification

反應(yīng)程序如下:(1)16S rDNA的PCR擴增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，30個循環(huán);72℃延伸10 min;(2)V3區(qū)的PCR擴增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);72℃延伸10 min。

以上所有PCR產(chǎn)物均用2.0%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測。

1.2.3 茶園根際土壤細菌V3區(qū)擴增產(chǎn)物的DGGE分析 變性梯度凝膠電泳:選擇聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為37.5∶1)，變性梯度范圍為35% ～60%(100%變性劑含有7 mol·L-1尿素和40%甲酰胺)。采用Bio-Rad變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)進行電泳，DNA擴增產(chǎn)物的上樣量為20 μL，電泳緩沖液為1×TAE緩沖液，60℃條件150 V電泳5 h左右。電泳結(jié)束后用SYBR Green I染色，棄去浸泡液，再在ddH2O中浸泡沖洗2 min，利用UVP凝膠成像分析系統(tǒng)照相。

DGGE圖譜分析:采用Quantity One(Bio-Rad)軟件對DGGE條帶進行數(shù)字化分析并采用UPGMA法進行聚類。DGGE條帶中DNA含量與其灰度(范圍0～255，0為最小值，255為最大值)呈線性關(guān)系，因此，用條帶灰度來代替每個DGGE條帶的擴增量(Ni)用于計算。每個條帶的相對含量pi為該條帶的灰度值Ni與該列所有條帶灰度值總和N的比值。細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)(H′)和均勻度指數(shù)(E)的計算方法為:

Pielou均勻度指數(shù)(Peilou，1977)(E)E=H′/lgS

其中，pi=Ni/N，Ni為樣本i的每一單獨條帶的灰度，N為樣本 i所有條帶灰度的總和;S為Richness豐富度指數(shù)，即DGGE圖譜中每一個樣本所含的條帶數(shù)目;采用生態(tài)學(xué)軟件Canoco對茶園根際土壤細菌群落與土壤理化性質(zhì)進行蒙特卡羅檢驗，并對茶園根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境變量之間的關(guān)系進行RDA分析。

1.2.4 DNA的回收、克隆及測序 在紫外燈下切割DGGE凝膠上不同位置的優(yōu)勢條帶，置于20 μL TE buffer中，4℃過夜。取2 μL為DNA模板進行16S rDNA V3可變區(qū)域擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE后，割膠回收，將其連接到PMD-19T vector(寶生物工程(大連)有限公司)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，搖床培養(yǎng)，涂板，挑取陽性克隆子，送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，利用BLAST對測序獲得的 DNA 序列進行比對分析(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤總DNA的提取及PCR擴增結(jié)果

經(jīng)測定，15個茶園根際土壤微生物總DNA的D260nm/D230nm集中在1.80 ～1.88 之間，D260nm/D280nm集中在1.70～1.75之間。電泳結(jié)果顯示土壤DNA片段大小約為2.30 kb(圖1);經(jīng)過PCR擴增，得到大小約為1500 bp的16S rDNA片段和230 bp的V3片段(圖2～3)。

圖1 土壤總DNA提取電泳圖Fig.1 Electrophoresis profiles of total DNA extracted from soil

2.2 茶園根際土壤細菌V3區(qū)的DGGE圖譜

茶園根際土壤細菌V3區(qū)的DGGE圖譜表明，茶園根際土壤細菌的16S rDNA片段經(jīng)DGGE分離為若干條帶，Quantity One圖像軟件對DGGE指紋圖譜進行分析，不同海拔梯度茶園根際土壤微生物中的DGGE條帶數(shù)目集中在19～28條。其中，條帶數(shù)最少的為5號茶園，海拔為600 m;條帶數(shù)最多的有28條，為9號和11號茶園，海拔均為400 m(圖4)。

對DGGE圖譜中樣本進行聚類分析(圖5)，15個樣本共聚為3大類:處于200 m海拔處的14、15號茶園和300 m海拔處的12、13號茶園聚為一類;處于500 m海拔處的6、7、8號茶園和400 m海拔處的9、10、11號茶園聚為一類;處于760 m 海拔處的1、2、3號茶園和600 m海拔處的4、5號茶園聚為一類(圖5)。由此可見，茶園根際土壤細菌群落聚類特征與茶園所處海拔梯度緊密相關(guān)。

圖5 DGGE圖譜的聚類分析Fig.5 Clustering analysis of DGGE profiles

在紫外燈照射下，從DGGE膠片上面割下14個強信號的條帶(A～N)進行PCR擴增、克隆、測序，并在NCBI中進行BLAST比對。結(jié)果可知，14個被測序列與NCBI已知序列的相似度除H外均為100%(表2)。鑒定結(jié)果表明，茶園根際土壤優(yōu)勢細菌主要是非可培養(yǎng)細菌，占80%;其余20%經(jīng)鑒定為可培養(yǎng)細菌，分別隸屬于根瘤菌屬Rhizobium、苜蓿中華根瘤菌屬Sinorhizobium和蒼白桿菌屬Ochrobactrum，其 登 錄 號 分 別 為 JN819573.1、JX133181.1 和 KC252620.1。

表2 測序比對結(jié)果Table 2 Alignment of sequences

續(xù)表2

從茶園根際土壤細菌群落Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分析(表3)結(jié)果來看，高海拔的茶園根際土壤細菌群落Shannon-Wiener多樣性指數(shù)相對較低，低海拔的樣本Shannon-Wiener多樣性指數(shù)相對較高，其中海拔為400 m的3個茶園(9、10、11)根際土壤細菌群落Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和豐富度均較高，分別為 3.27、3.20、3.32 和 28、26、29;均勻度指數(shù)也存在類似規(guī)律(表3)。

表3 茶園根際土壤細菌群落基因多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity index of bacterial communities in the rhizosphere soil of tea plantations

2.3 茶園根際土壤細菌群落的環(huán)境特性

研究表明，土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成受環(huán)境因素(如土壤pH值，C/N值，有機質(zhì)等)的影響。生態(tài)學(xué)上一般采用Canoco軟件進行環(huán)境變量貢獻率分析，本研究利用Canoco對茶園根際土壤細菌群落和土壤理化性質(zhì)進行蒙特卡羅檢驗，結(jié)果可知，磷(P)在所有環(huán)境因子中的貢獻率最高，達到10.64%;其次為A-P，解釋的變異率為10.47%;其余環(huán)境變量對茶園根際細菌群落分布的貢獻依次降低(表4)。由此可知，土壤的理化性質(zhì)中對茶園根際土壤細菌群落按照海拔能夠聚類這一結(jié)果起主要解釋作用的環(huán)境變量為P。同時發(fā)現(xiàn)，所有環(huán)境因子協(xié)同作用對茶園根際土壤細菌微生物群落結(jié)構(gòu)的貢獻率達到59.60%(表4)。從p值來看，雖然P在所有環(huán)境變量中貢獻最大，但其p值并未達到顯著水平(p＜0.05)。由于茶園根際微環(huán)境較為復(fù)雜，茶樹根際土壤營養(yǎng)循環(huán)的過程由各種因素共同決定的，從土壤理化性質(zhì)方面來講，P起著主導(dǎo)作用，但它與其他環(huán)境變量協(xié)同作用，在茶園根際這個微域環(huán)境中對微生物的群落結(jié)構(gòu)形成具有一定的影響作用。

表4 蒙特卡羅檢驗結(jié)果Table 4 Result of Monte Carlo test

對茶園根際土壤細菌群落和環(huán)境變量P進行冗余分析(圖6)，得到各個海拔梯度的茶園根際土壤細菌群落在環(huán)境因子P的方向上的分布情況。由分析結(jié)果可見，15個茶園根際土壤細菌群落樣本在P的方向上按照海拔特征依次聚類，其中海拔600 m的樣本4、5聚為一類，海拔500 m的樣本6、7、8聚為一類，海拔400 m樣本9、10、11聚為一類，海拔為300和200 m 的樣本12、13、14、15聚為一類，海拔760 m的樣本1、2、3聚為一類(圖6)。此結(jié)果與DGGE聚類的結(jié)果一致，共同說明茶園根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與海拔梯度密切相關(guān)。

3 討論

近年來，茶園根際土壤微生物的研究及其功能微生物開發(fā)利用方面已經(jīng)取得不少進展。?akmak? et al.(2010)研究發(fā)現(xiàn)茶園土壤中可培養(yǎng)的細菌主要有芽孢桿菌屬Bacillus(34.6%)、假單胞菌屬Pseudomonas(8.9%)、寡 養(yǎng) 單 胞 菌 屬 Stenotrophomonas(6.1%)、類芽孢桿菌屬 Paenibacillus(5.9%)和節(jié)桿菌屬 Arthrobacter(4.8%)。Saikia et al.(2011)已對從茶園根際土壤分離到的25種假單胞菌進行拮抗活性和代謝產(chǎn)物的研究，發(fā)現(xiàn)了抗生素2，4-diacetylphloroglucinol(DAPG)和 pyoluteorin(PLT)的編碼基因Pf12和Pf373。本研究的試驗結(jié)果表明，安溪茶園根際細菌中非可培養(yǎng)細菌居多，可培養(yǎng)的細菌較少，主要是根瘤菌、苜蓿中華根瘤菌和人蒼白桿菌。有報道表明，苜蓿中華根瘤菌在土壤體系中具有強固氮作用(管鳳貞等，2012)，人蒼白桿菌因其自身耐藥性比較強而能夠分解土壤中殘留的農(nóng)藥(王偉霞等，2010)。因此，從安溪茶園根際土壤中鑒定到的苜蓿中華根瘤菌和人蒼白桿菌是否同樣具有相應(yīng)的作用值得進行進一步研究。

茶園根際土壤微生物多樣性的研究已有報道，鄭雪芳等(2010)利用PLFA生物標記法研究了不同海拔梯度茶園根系土壤微生物群落多樣性，得到不同的PLFA在不同海拔梯度茶樹根系土壤分布差異明顯，其中，高海拔(834 m)茶樹根系土壤分布的PLFA種類和數(shù)量都最多。聚類分析和冗余分析結(jié)果共同表明，茶園根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與海拔分布緊密相關(guān)，中間海拔細菌豐富度相對低海拔和高海拔細菌更高，400 m海拔處Shannon-Wiener多樣性指數(shù)最高，平均值為3.26，細菌種類最豐富;本研究取樣的茶園集中于福建省泉州市安溪縣西坪鎮(zhèn)和感德鎮(zhèn)2個地方，土壤均為紅壤，兩地區(qū)氣候條件相似，排除氣候差異等的影響，結(jié)果分析表明，影響茶樹根際微生物群落的主要因素為海拔梯度、肥力狀況和土壤本身理化性質(zhì)。相對于最高海拔760 m和最低海拔200 m，處于中間梯度的400 m海拔梯度，其生態(tài)系統(tǒng)比較適宜更多的細菌類群生存。

圖6 茶園根際土壤細菌群落的RDA分析Fig.6 RDA analysis of bacterial communities in the rhizosphere soil of tea plantations

本研究結(jié)果還表明，P是所有環(huán)境變量中影響安溪茶園根際細菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子，它對該地區(qū)茶園細菌群落分布的貢獻達到10.64%，所有環(huán)境因素協(xié)同作用對該地區(qū)細菌群落分布的影響占59.6%。而He et al.(2008)也證明P是所有茶園根際土壤環(huán)境因子中影響微生物群落分布的關(guān)鍵因子，同時Zheng et al.(2012)發(fā)現(xiàn)有機質(zhì)、速效磷、氮，與土壤中微生物種群分布有一定相關(guān)作用。

茶園根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是一個復(fù)雜的有機體，本研究主要明確了細菌群落結(jié)構(gòu)分布與海拔梯度及土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，對于茶園根際環(huán)境中真菌、放線菌的研究也有待進一步進行，同時對于其他環(huán)境因子的研究也尚待深入。

管鳳貞，邱宏端，陳濟琛，林新堅.2012.根瘤菌菌劑的研究與開發(fā)現(xiàn)狀.生態(tài)學(xué)雜志.31(3):755-759.

洪禎瑞，王益福，方月珍，董金甫，李能樹.1985.茶樹根際微生物區(qū)系的研究.茶葉科學(xué)，(2):9-16.

胡磊.2010.套種圓葉決明和施肥對茶園土壤固氮微生物群落的影響.福州:福建農(nóng)林大學(xué).

石錦芹，丁瑞興，劉友兆，孫玉華.1999.尿素和茶樹落葉對土壤的酸化作用.茶葉科學(xué)，(1):7-12.

李福榮，周強，史崢賢，王彩麗.2009.信陽毛尖茶樹根際微生物群落組成與茶葉質(zhì)量的關(guān)系.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，37(22):65.

王偉霞，李福后，王文鋒.2010.微生物在土壤污染中的生物修復(fù)作用.北方園藝，(4):1208-1211.

許愛清，李宗軍，王遠亮，文杰宇.2010.應(yīng)用 PCR-DGGE技術(shù)檢測發(fā)酵食品和飼料中真菌菌群.食品科學(xué)，31(7):317-321.

鄭雪芳，蘇遠科，劉波，藍江林，楊述省，林營志.2010.不同海拔茶樹根系土壤微生物群落多樣性分析.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，18(4):886-871.

Araya R，Tani K，Takagi T，Yamaguchi N and Nasu M.2006.Bacterial activity and community composition in stream water and biofilm from an urban river determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis.FEMS Microbiology Ecology，43:111-119.

Braak C J.1988.CANOCO-an extension of DECORANA to analyze species-environment relationships.Plant Ecology，75，159-160.

?akmak? R，D?nmez M F，Ertürk Y，Erat M，Haznedar A and Sekban R.2010.Diversity and metabolic potential of culturable bacteria from the rhizosphere of Turkish tea grown in acidic soils.Plant and Soil，332:299-318.

Ercolini D.2004.PCR-DGGE fingerprinting:novel strategies for detection of microbes in food.Journal of Microbiological Methods，56:297-314.

Haq Q M R，Sharma G D，Huidrom P and Jan A T.2011.Molecular characterization of endosulfan tolerant Rhizospheric microbes from tea gardens of Silchar assam India.Journal of ExA-Primental Sciences，2(2):12-15

He J Z，Zheng Y，Chen C R，He Y Q and Zhang L M.2008.Microbial composition and diversity of an upland red soil under long-term fertilization treatments as revealed by culturedependent and culture-independent approaches.Journal of Soils and Sediments，8:349-358.

Pielou E C.1975.Ecological Diversity.New York:Wiley.

Robert C P，Casella G and Robert C P.1999.Monte Carlo Statistical Methods(Vol.58).New York:Springer.

Saikia R，Sarma R K，Yadav A and Bora T C.2011.Genetic and functional diversity among the antagonistic potential fluorescent pseudomonads isolated from tea rhizosphere.Current microbiology，62:434-444.

Shannon C E and Weaver W.1949.The Mathematical Theory of Communication.Urbana:University of Illinois Press.

Tachibana N，Yoshikawa S and Ikeda K.1995.Influences of heavy application of nitrogen on soil acidification and root growth in tea［Camellia sinensis］fields.Japanese Journal of Crop Science，64:516-522.

van den Wollenberg A L.1977.Redundancy analysis an alternative for canonical correlation analysis.Psychometrika，42:207-219.

Zheng Y，Tian X F，Shen J P and Zhang L M.2012.Methanotrophic abundance and community fingerprint in pine and tea plantation soils as revealed by molecular methods.African Journal of Biotechnology，11:11807-11814.

Zou X M ，Ruan H H，F(xiàn)u Y，Yang X D and Sha L Q.2005.Estimating soil labile organic carbon and potential turnover rates using a sequential fumigation-incubation procedure.Soil Biology and Biochemistry，37:1923-1928.

附表1 土壤樣本信息Additional table 1 Information of samples

附表2 樣本理化性質(zhì)Additional table 2 The physicochemical properties of samples