GC-MS分析好氧顆粒污泥降解黃連素的產物

劉風華,宋永會,王全紅,韓 雙,宋寶華,胡 霖

（1. 中國環(huán)境科學研究院 城市水環(huán)境研究室,北京 100012；2. 中節(jié)能六合天融環(huán)?？萍加邢薰?北京 100082；3. 北京市畜牧業(yè)環(huán)境監(jiān)測站,北京 102200）

黃連素又叫小檗堿，分子式C20H18NO4，相對分子質量 336.37，黃色結晶性粉末，無嗅，味極苦，是一種具有多種藥理學和生物學作用的異喹啉天然生物堿，為目前廣泛使用的一種廣譜抗菌藥物，對多種革蘭陽性及陰性菌均產生強烈抑制作用［1］。制藥行業(yè)化學合成黃連素成品母液因其含強抑菌性物質黃連素，嚴重影響常規(guī)廢水生物處理單元的處理效果，屬于難生物降解的高濃度有機廢水。好氧顆粒污泥是微生物細胞通過自身固定化形成的一種特殊形式的生物膜。最早有關好氧顆粒污泥的研究始于上世紀90年代［2-3］，自從Morgenroth等［4］在SBR中成功培養(yǎng)出了好氧顆粒污泥后，SBR的運行模式一直被廣泛用來培養(yǎng)好氧顆粒污泥。目前，幾乎所有好氧顆粒污泥的培養(yǎng)和穩(wěn)定化運行都是在SBR及其變形反應器中實現(xiàn)的［5-6］。好氧顆粒污泥密實的結構、高效的生物學特性、豐富的微生物相組成、優(yōu)異的沉降性能、高的有機負荷和毒性物質的耐受性，使其具有普通活性污泥不可比擬的優(yōu)點［7］，已經(jīng)廣泛應用于氟苯酚、內分泌干擾物等有毒有害廢水的處理中［8-10］。

本工作采用實驗室培養(yǎng)的成熟好氧顆粒污泥降解黃連素，基于GC-MS技術分析好氧顆粒污泥降解黃連素的代謝產物。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

黃連素：純度為99%；二氯甲烷、正己烷、甲醇：色譜純。

6890 -5973型GC-MS儀：C 18柱，美國Agilent公司；微孔過濾膜：孔徑0.45 μm，北京佳源興業(yè)科技有限公司； Oasis HCB型固相萃取柱：沃特世科技（上海）有限公司；Quanta200型掃描電子顯微鏡：美國FEI公司。

1.2 實驗方法

在含有以醋酸鈉為唯一碳源培養(yǎng)成熟的好氧顆粒污泥的SBR內，對質量濃度為10 mg/L的黃連素模擬廢水進行處理，取反應器出水分析降解產物。SBR反應器為圓柱形，內徑6 cm，高150 cm，有效容積2.8 L。穩(wěn)定階段運行參數(shù)：運行周期360 min（進水5 min，曝氣345 min，沉淀5 min，排水5 min），曝氣量240 L/h，表面氣速2.4 cm/s，換水率50%。

1.3 分析方法

水樣的前處理采用固相萃取方法：依次用5 mL二氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL純水分別對固相萃取柱進行活化；然后將經(jīng)過孔徑0.45 μm膜過濾的500 mL水樣通過固相萃取柱進行富集；采用質量分數(shù)70%正己烷和質量分數(shù)30%二氯甲烷混合液10 mL洗脫C 18柱，采用質量分數(shù)90%二氯甲烷和質量分數(shù)10%甲醇混合液10 mL洗脫Oasis HCB柱；洗脫液混合，用無水硫酸鈉脫水，旋蒸、氮吹定容至1 mL，進行GC-MS分析。

氣相色譜條件：載氣為高純氦氣，不分流進樣1 μL，進樣口溫度280 ℃，檢測器溫度290 ℃。初始柱溫50 ℃，穩(wěn)定2 min，程序升溫至290 ℃，升溫速率6 ℃/min，恒溫15 min。質譜條件：電子轟擊式離子源，離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150℃，離子源電壓70 eV，質量掃描范圍35～500 amu（原子質量單位）。

2 結果與討論

2.1 成熟好氧顆粒污泥形態(tài)特征

成熟好養(yǎng)顆粒污泥外觀形態(tài)見圖1。由圖1可見，好癢顆粒污泥外表光滑、結構密實、呈黃色。經(jīng)測定，各項理化指標分別為MLSS 20 855 mg/L，SVI 24.64 mL/g、VSS∶SS 0.81、比耗氧速率232.21 mg /（g · h）。成熟好氧顆粒污泥粒徑分布見圖2。由圖2可見，成熟好養(yǎng)顆粒污泥粒徑主要介于100～1 000 μm。

圖1 成熟好養(yǎng)顆粒污泥外觀形態(tài)

圖2 成熟好氧顆粒污泥粒徑分布

2.2 黃連素降解產物分析

對好氧顆粒污泥反應器處理黃連素模擬廢水的穩(wěn)定出水進行GC-MS分析。黃連素降解產物的GC-MS離子流譜圖見圖3。

圖3 黃連素降解產物GC-MS離子流譜圖

由圖3可見：在保留時間為 22.682，24.451，25.017，25.209，26.652，31.177 min時分別呈現(xiàn)出6個特征色譜峰。

黃連素降解產物的質譜譜圖見圖4。由圖4可見：保留時間為22.682 min處色譜峰相對分子質量是180，其質譜圖與6-甲氧苯并二氫呋喃-7-醇-3-酮相符；保留時間為24.451 min處色譜峰相對分子質量是166，是相對濃度最大的峰之一，與2，5-二甲氧基苯甲醛質譜圖一致；保留時間為25.017 min處色譜峰相對分子質量是193，與4-烯丙基-5-氨基-藜蘆醚質譜圖一致；保留時間為25.209 min處色譜峰相對分子質量是180，與2，4-二羥基-6-甲基-1，3-間苯二甲醛質譜圖相符；保留時間為26.652 min處色譜峰相對分子質量是208，是相對濃度最大的峰之一，其質譜圖與3，4-亞甲基二氧苯基丙酮酸相符；保留時間為31.177 min處色譜峰相對分子質量是191，是相對濃度最大的峰之一，與1，3-二噁唑并（4，5-g）異喹啉-5（6H）-酮，7，8-二氫質譜圖相符。

根據(jù)GC-MS的分析結果，經(jīng)過360 min的降解，黃連素被好養(yǎng)顆粒污泥分解為：6-甲氧苯并二氫呋喃-7-醇-3-酮；2，5-二甲氧基苯甲醛；4-烯丙基-5-氨基-藜蘆醚；2，4-二羥基-6-甲基-1，3-間苯二甲醛；3，4-亞甲基二氧苯基丙酮酸；1，3-二噁唑并 （4，5-g）異喹啉-5（6H）-酮，7，8-二氫。

圖4 黃連素降解產物質譜譜圖

2.3 好氧顆粒污泥電鏡分析

好氧顆粒污泥降解黃連素前（a）后（b）的電鏡照片見圖5。由圖5（a）可見：為了克服好氧顆粒污泥密實結構對氧氣和基質向內部傳遞的阻礙，顆粒污泥中還分布有許多孔隙和通道，基質和氧氣通過這些通道能夠更好地向內層細菌擴散。由圖5（b）可見：降解黃連素后，好養(yǎng)顆粒污泥表面存有黏膠層，使好養(yǎng)顆粒污泥表面的球菌和類短桿菌緊密黏結在一起，盡管其空隙和通道變小，但其結構更加致密，這種致密的菌群排列結構賦予污泥良好的沉降性能、生物活性和抗毒物沖擊能力。

圖6 好氧顆粒污泥降解黃連素前（a）后（b）的電鏡照片

3 結論

a）采用GC-MS技術分析好氧顆粒污泥對黃連素的降解產物，經(jīng)過360 min降解，黃連素被分解為6-甲氧苯并二氫呋喃-7-醇-3-酮；2，5-二甲氧基苯甲醛；4-烯丙基-5-氨基-藜蘆醚；2，4-二羥基-6-甲基-1，3-間苯二甲醛；3，4-亞甲基二氧苯基丙酮酸；1，3-二噁唑并 （4，5-g）異喹啉-5（6H）-酮，7，8-二氫。

b）降解黃連素后，好養(yǎng)顆粒污泥結構更加致密，這種致密的菌群排列結構賦予污泥良好的沉降性能、生物活性和抗毒物沖擊能力。

［1］ Creasey W. Biochemical effects of berberinbe［J］. Biochem Pharmacol,1979,28（7）：1081-1084.

［2］ Mishina K,Nakamuram. Self immobilization of aerobic activated sludge：A pilot study of the aerobic up flow sludge blanket process in municipal sewage treatment［J］. Water Sci Technol,1991,23（4）：981-990.

［3］ Shin H S,Lim K H,Park H S. Effect of shear stress on granulation in oxygen aerobic up fl ow sludge bed reactors［J］. Water Sci Technol,1992,26（3/4）：601-605.

［4］ Morgenroth E,Sherden T,van Loosdrecht M C M,et al. Aerobic granular sludge in a sequencing batch reactor［J］. Water Res,1997,31（12）：3191-3194.

［5］ Zeng Ping,Zhuang Weiqin,Tay S T L,et al. The inf l uence of storage on the morphology and physiology of phthalic acid degrading aerobic granules［J］. Chemosphere,2007,69（11）：1751-1757.

［6］ Zhao Dongfeng,Liu Chunshuang,Zhang Yunbo,et al. Biodegradation of nitrobenzene by aerobic granular sludge in a sequencing batch reactor (SBR)［J］. Desalination,2011,281：17-22.

［7］ Adav S S,Lee Duujong,Show K Y,et al. Aerobic granular sludge：Recent advances［J］. Biotechnol Advance,2008,26（5）：411-423.

［8］ Duque Anouk F,Bessa Vania S,Carvalho Maria F,et al. 2-Fluorophenol degradation by aerobic granular sludge in a sequencing batch reactor［J］. Water Res,2011,45：6745-6752.

［9］ Wei Yanjie,Ji Min,Li Ruying,et al. Organic and nitrogen removal from landf i ll leachate in aerobic granular sludge sequencing batch reactors［J］. Waste Managem,2012,32：448-455.

［10］ Balest L,Lopez A,Mascolo G,et al. Removal of endocrine disrupter compounds from municipal wastewater using an aerobic granular biomass reactor［J］.Biochem Eng J,2008,41（3）：288-294.