楊金龍 , 李無霜 梁 簫 沈和定 , 李家樂

(1. 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 上海 201306; 3. 上海高校知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心, 上海 201306)

隨著生物化學(xué)技術(shù)的不斷深入發(fā)展, 在海洋無脊椎動物中有關(guān)蛋白質(zhì)的研究也越來越多。其中western blot用來對蛋白表達(dá)做定量定性分析, 2-DE和質(zhì)譜技術(shù)等相結(jié)合鑒定蛋白質(zhì)組分。這一系列蛋白質(zhì)研究技術(shù)都有賴于對樣品蛋白的提取。在研究厚殼貽貝等海洋無脊椎動物不同發(fā)育階段過程中,其新鮮樣品的采集受到很大程度的限制, 例如采樣時間、采樣地點(diǎn)等, 為蛋白相關(guān)研究工作的開展帶來了諸多困難。

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)是中國重要的貝類養(yǎng)殖品種, 分布于黃海、渤海和東海沿岸, 其中以浙江沿海資源量最大。關(guān)于厚殼貽貝的其遺傳特性[1]、附著特性[2]、低溫保存[3]、繁殖發(fā)育[4,5]、生態(tài)毒理[6]等方面已開展了大量的研究工作, 主要集中在厚殼貽貝的幼體和成體兩個發(fā)育階段。與許多其他海洋無脊椎動物一樣, 厚殼貽貝幼體也要經(jīng)過重要的階段—附著和變態(tài), 在變成附著稚貝后, 其附著數(shù)量直接影響著苗種的產(chǎn)量。然而, 關(guān)于厚殼貽貝稚貝的研究鮮有報(bào)道[7]。

目前, 有關(guān)不同保存方法提取蛋白的比較研究尚未見報(bào)道, 本實(shí)驗(yàn)以厚殼貽貝稚貝為材料, 采用直接冷凍法、添加海水冷凍法以及蛋白裂解液冷凍法等3種保存方法。分別保存1周、2周、3周、4周、2個月、3個月和6個月對其進(jìn)行蛋白提取, 聚丙烯酰胺凝膠電泳對所提蛋白進(jìn)行比較分析, 旨在探尋合適保存樣品的方法用以提取蛋白以供進(jìn)一步研究。

1 材料和方法

1.1 樣品處理

厚殼貽貝樣品采集于浙江洞頭的稚貝, 其平均殼長2.8 mm, 殼高1.8 mm。實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周后, 挑選健康狀態(tài)良好的稚貝收集于離心管, 分別用 3種不同方法進(jìn)行保存。

直接冷凍法為直接將樣品用液氮快速冷凍, 后放入-80℃冰箱保存; 海水冷凍法時, 向樣品中添加1 mL 滅菌海水, 后用液氮快速冷凍, 最終保存于-80℃冰箱中; 蛋白裂解液冷凍法為向樣品中添 1 mL蛋白裂解液(10 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 5% Tritonx-100和2 mmol/L PMSF), 用液氮快速冷凍, 最終放入-80℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)過程中, 保存時間為1周、2周、3周、4周、2個月、3個月和6個月。

1.2 蛋白樣品的制備

直接冷凍法中蛋白樣品制備時, 先進(jìn)行樣品稱質(zhì)量, 加入 4倍體積的蛋白裂解液, 于冰上勻漿 3次, 每次30 s, 將勻漿液分裝到1.5 mL離心管, 4℃10 000 g離心30 min, 收集上清即為可溶性蛋白。海水冷凍法中蛋白樣品制備時, 將樣品溶解, 除去其中的滅菌海水, 加入4倍體積的蛋白裂解液, 勻漿和離心方法同上。蛋白裂解液冷凍法中蛋白樣品制備時, 將樣品溶解后, 將 1 mL蛋白裂解液吸出, 置于1.5 mL離心管中稱質(zhì)量, 計(jì)算出所需裂解液的總量。將原有1 mL蛋白裂解液和補(bǔ)充裂解液加入, 最終為4倍體積的蛋白裂解液, 勻漿和離心方法同上。

1.3 蛋白定量

將制得的蛋白上清取20 μL稀釋到100 μL后用Lowry法蛋白含量測定試劑盒(PRL000100), 測定不同保存時間, 各保存方法蛋白樣品中所含的蛋白量。

1.4 SDS-PAGE電泳檢測

取 100 μL 蛋白原液, 加入 100 μL SDS-buffer上樣緩沖液, 水浴煮沸 10 min制成上樣樣品。上樣量為10.05 μg蛋白, 用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 考馬斯亮藍(lán)染色, 伯樂凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。結(jié)果用Quantity One軟件估算條帶的相對分子量及灰度值。

2 結(jié)果

3種保存方法在不同保存時間內(nèi)所提蛋白樣品的質(zhì)量如圖1所示。SDS-PAGE膠上最為明顯有規(guī)律的4個條帶a、b、c、d, 其相對分子量依次約為55、46、38和26 kDa。同時, 基于SDS-PAGE蛋白條帶,Quantity One軟件檢測條帶a, b, c, d的灰度值結(jié)果如表1所示。分析條帶a發(fā)現(xiàn), 3種保存方法均在保存3周內(nèi)未檢測到條帶, 到第4周條帶明顯, 保存時間延長至2個月時條帶灰度值增加, 保存3個月時出現(xiàn)減弱趨勢, 到保存 6個月后條帶的灰度值降為 0。3種保存方法下, 條帶 a的灰度值總體趨勢均呈先增加后減少。分析條帶b可發(fā)現(xiàn), 直接冷凍保存法與添加海水冷凍法均呈先增加后降低趨勢; 蛋白裂解液冷凍法研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存1個月內(nèi)呈逐漸降低趨勢,當(dāng)保存 2個月后條帶灰度值呈現(xiàn)增加。分析條帶 c的灰度值發(fā)現(xiàn), 3種不同保存方法整體趨勢呈增加趨勢。同樣, 條帶 d在6個月保存時間內(nèi), 3種保存方法整體趨勢也呈增加趨勢。由此可見, 條帶a的灰度值在 3種不同保存方法下呈現(xiàn)相同趨勢, 無法作為鑒定保存方法良否的依據(jù)。同樣, 條帶c和d的灰度值在 3種不同保存方法下呈現(xiàn)相同趨勢, 無法作為鑒定保存方法良否的依據(jù)。直接冷凍法和添加海水冷凍法結(jié)果均顯示條帶 b的灰度值呈現(xiàn)先增加后降低趨勢; 蛋白裂解液冷凍法結(jié)果與前兩種保存方法不同, 呈先降低后增加趨勢。因此, 將條帶b可作為衡量3種保存方法良否的標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

對不同保存方法DNA提取比較的研究已經(jīng)很深入, 例如冷凍保存、75%乙醇保存、EDTA結(jié)合乙醇保存以及甲醛等保存方法[8-10]。然而, 有關(guān)保存方法和保存時間對樣品蛋白提取影響的研究工作還未開展。作者首次通過直接冷凍法、添加海水冷凍法以及蛋白裂解液冷凍法等 3種方法開展了厚殼貽貝稚貝樣品的保存工作, 確定了其最佳樣品保存方法。

樣品冷凍保存過程中蛋白酶的存在可能導(dǎo)致樣品中蛋白發(fā)生不同程度的降解。自然界中根據(jù)蛋白酶活性中心分為四大類蛋白酶, 分別為絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、巰基蛋白酶以及酸性蛋白酶。在本研究中, 研究對象厚殼貽貝其生活史、包括稚貝在內(nèi)的各個發(fā)育階段均生活在海水環(huán)境中; 自然海水一般偏堿性, 絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶具有一定的活性, 可能會降解相關(guān)蛋白, 在蛋白裂解液中, 因而選用了2種蛋白酶抑制劑PMSF和EDTA, 分別可抑制絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。直接冷凍法和添加海水冷凍法的結(jié)果表明a、b、c、d 等4條條帶在6個月保存過程中, 呈現(xiàn)整體增加的趨勢。原因可能是由于在保存過程中, 無添加任何蛋白酶抑制劑,促使較大分子量的蛋白在蛋白酶的作用下, 出現(xiàn)降解現(xiàn)象, 其分解產(chǎn)物在原有a、b、c、d等4條條帶上基礎(chǔ)出現(xiàn)累積現(xiàn)象。蛋白裂解液冷凍法的研究發(fā)現(xiàn), 條帶a、c、d與直接冷凍法和添加海水冷凍法結(jié)果相似, 均呈整體增加趨勢, 其原因可能是由于在蛋白裂解液中添加的 2種蛋白酶抑制劑 PMSF和EDTA無法完全抑制樣品中一些大分子量蛋白的降解; 此外, 可能由于其余兩大類的蛋白酶巰基蛋白酶和酸性蛋白酶發(fā)揮了作用, 導(dǎo)致大分子量蛋白的降解。條帶b在1個月內(nèi)呈現(xiàn)降低的趨勢, 之后呈增加的趨勢, 其原因可能是在蛋白裂解液中添加的 2種蛋白酶抑制劑PMSF和EDTA在一定程度上抑制了樣品中一些大分子量蛋白的降解, 從而使分解產(chǎn)物未在條帶b上基礎(chǔ)進(jìn)行累積。這一過程中, 條帶b的減少, 可能是其樣品保存過程中損耗所導(dǎo)致。此外,條帶b的結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存2個月后其灰度值出現(xiàn)增加現(xiàn)象, 可能是由于長時間保存過程中蛋白裂解液中添加的2種蛋白酶抑制劑的作用減弱所致。

圖1 不同保存條件下的厚殼貽貝稚貝蛋白樣品SDS-PAGEFig. 1 SDS-PAGE of samples of Mytilus coruscus juvenile stored in different methods

表1 不同保存方法的蛋白條帶分析Tab. 1 The analysis of SDE-PAGE in different methods

綜上, 條帶 b可作為厚殼貽貝稚貝樣品保存方法良否的標(biāo)準(zhǔn)。1個月內(nèi), 蛋白裂解液中的方法最佳,直接冷凍法和添加海水冷凍法的研究發(fā)現(xiàn)保存過程中的蛋白均出現(xiàn)不同程度的降解現(xiàn)象, 因而可能不適宜用于該種稚貝樣品的保存。

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