藍(lán)隱藻藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定性研究

李文軍, 陳 敏

(煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005)

藻膽蛋白是存在于藍(lán)藻、紅藻、部分隱藻和甲藻中的捕光色素蛋白復(fù)合物, 它們吸收 500～650 nm的可見(jiàn)光, 并將吸收的光能傳遞給膜上的反應(yīng)中心進(jìn)行光合作用。由于藻膽蛋白在可見(jiàn)光區(qū)和近紫外區(qū)都有明顯的特征吸收, 并且具有很高的熒光量子產(chǎn)率, 作為一個(gè)天然內(nèi)標(biāo), 其色基與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合狀態(tài)以及蛋白質(zhì)所處的內(nèi)部微環(huán)境的微小變化,都可以在其光譜性質(zhì)上呈現(xiàn)出很靈敏的反映, 因此是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的難得材料。

隱藻是一類(lèi)單細(xì)胞、結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的雙鞭毛藻類(lèi),在淡水和海水中都有分布[1]。每種隱藻只含有一種藻膽蛋白[2], 或者藻藍(lán)蛋白(PC)或者藻紅蛋白(PE)。目前, 對(duì)于紅、藍(lán)藻中的藻膽蛋白, 無(wú)論結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及組裝而成的藻膽體等, 都有相當(dāng)透徹的研究, 但是對(duì)于隱藻藻膽蛋白卻了解較少, 其蛋白亞基的性質(zhì)、彼此之間的組裝和連接方式, 以及與膜上反應(yīng)中心的接觸等情況, 目前都不完全確定[3]。本文使用的藍(lán)隱藻(Chroomonas placiodea)只含有一種藻藍(lán)蛋白PC-645。據(jù)報(bào)道, PC-645含有α1、α2和β三種亞基, 通過(guò)半胱氨酸的硫醚鍵共價(jià)連接多個(gè)色素基團(tuán), 包括藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin,PCB),藻紫膽素(phycobiliviolin, PXB)和在長(zhǎng)波端697 nm有最大吸收的一種色素基團(tuán)(mesobiliverdin, 也稱(chēng)MBV)。色基吸收的光能從PXB經(jīng)PCB、MBV, 最終傳遞給膜上的葉綠素[4]。PC-645亞基通過(guò)折疊形成球形的三級(jí)結(jié)構(gòu), 并以(α1β)(α2β)異二聚體方式形成四級(jí)結(jié)構(gòu), 為色素基團(tuán)提供了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境, 并且使其相互靠近, 從而保證能量傳遞功能的實(shí)現(xiàn)[5]。目前對(duì)藻膽蛋白結(jié)構(gòu)、功能和重折疊的研究只限于紅、藍(lán)藻藻膽蛋白, 而對(duì)隱藻藻膽蛋白尚未有報(bào)道。由于隱藻藻膽蛋白是位于類(lèi)囊體膜內(nèi)側(cè)或堆積在膜腔中[6-7], 而不是伸展在葉綠體基質(zhì)中,伴隨著光合作用過(guò)程中葉綠體內(nèi)環(huán)境的變化, 其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化與位于基質(zhì)中的紅、藍(lán)藻藻膽蛋白必然有所不同, 并可能導(dǎo)致其能量傳遞效率的改變。為此, 本文以藍(lán)隱藻(C.placiodea)PC-645為材料, 在不同 pH和不同質(zhì)量濃度尿素中, 通過(guò)對(duì)熒光光譜、吸收光譜的監(jiān)測(cè),研究藍(lán)隱藻 PC-645蛋白的變性和復(fù)性動(dòng)力學(xué), 以及蛋白結(jié)構(gòu)和能量傳遞功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 PC-645樣品制備

藍(lán)隱藻(C. placiodea)的培養(yǎng)和PC-645的制備、純化方法參照文獻(xiàn)[8]。純化的80%硫酸銨沉淀的PC-645,經(jīng) Pall 30kDa超濾管濃縮, 并調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為50 g/L待用。以下操作全部于室溫、弱光下進(jìn)行。

1.2 pH變性及復(fù)性實(shí)驗(yàn)

采用0.1 mol/L的HCL或0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié) 0.2 mmol/L的磷酸氫二鉀緩沖液 pH, 經(jīng)HANNA PH211臺(tái)式酸度計(jì)檢測(cè), 配制成不同pH緩沖液。將濃縮后的PC-645用相應(yīng)pH的緩沖液稀釋至蛋白終質(zhì)量濃度為2 g/L和0.1g/L, 渦旋混勻后放置10 min, 分別用于吸收和熒光光譜的測(cè)定[9-10]。

1.3 極端pH下時(shí)間耐受性實(shí)驗(yàn)

如1.2操作, 在pH3條件下分別調(diào)節(jié)PC-645蛋白終質(zhì)量濃度為2 g/L和0.1g/L, 在60 min內(nèi)間隔取樣, 分別用于測(cè)定吸收和熒光光譜。

1.4 尿素變性及復(fù)性實(shí)驗(yàn)

高質(zhì)量濃度尿素變性實(shí)驗(yàn)中, PC-645被稀釋至不同pH值的尿素溶液中, 尿素終質(zhì)量濃度為8 mol/L, 蛋白終質(zhì)量濃度為 2 g/L; 尿素復(fù)性實(shí)驗(yàn)時(shí), 蛋白質(zhì)量濃度為2 g/L的PC-645在終質(zhì)量濃度為3 mol/L的尿素(含50 mmol PBS)緩沖液中變性1h后, 置于半透膜中對(duì)純水透析除去尿素, 定時(shí)取樣測(cè)定吸收光譜。

1.5 吸收光譜測(cè)定

采用TU-1900紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè), 掃描范圍250～750 nm, 蛋白終質(zhì)量濃度為2 g/L, 光徑1 cm,步長(zhǎng)1 nm。

1.6 熒光光譜測(cè)定

用 PerkinElmer LS55 熒光分光光度計(jì)檢測(cè), 蛋白終質(zhì)量濃度為0.1 g/L, 光徑1 cm。

2 pH耐受光譜動(dòng)力學(xué)

2.1 吸收光譜

天然狀態(tài)下的 PC-645在可見(jiàn)光區(qū)有 582、625和645 nm三個(gè)特征峰吸收峰[11], 其中582 nm峰對(duì)應(yīng)于PXB色基的吸收, 625 nm吸收肩峰對(duì)應(yīng)于PCB,兩者以1:1關(guān)系存在于β亞基上; 而645 nm吸收對(duì)應(yīng)于 MBV, 其吸收范圍可跨越 640～695 nm, 為α亞基所僅有[12]。隨著環(huán)境中pH的降低, 藻藍(lán)蛋白光吸收逐漸減弱(圖1A)。在pH低于3時(shí), 吸光度下降非常快, 原582 nm和650 nm最大光吸收紅移, 在pH低于2.5時(shí), 吸收峰融合為一個(gè)600～700 nm的較寬吸收峰, 可能是α亞基構(gòu)象改變, MBV色基暴露的結(jié)果。PC-645的α亞基含有較多堿性氨基酸[4,13], 當(dāng)外界pH環(huán)境較低時(shí),α亞基更易于受到影響, 所帶負(fù)電荷減少, 亞基變性伸展, 結(jié)合在 Cys α19上的 MBV色基暴露, 表現(xiàn)吸收峰紅移。在堿性溶液中, 藻藍(lán)蛋白吸收光譜在pH 7～10時(shí)較為穩(wěn)定(圖1B), 而pH超過(guò)10.25時(shí), 吸收光譜強(qiáng)度下降顯著。與酸性環(huán)境中相同的是, 582 nm最大光吸收處出現(xiàn)紅移; 不同的是,645 nm處最大光吸收處出現(xiàn)了藍(lán)移, 并且沒(méi)有屬于MBV的670～700 nm長(zhǎng)波吸收峰顯現(xiàn); 顯然α亞基在堿性條件下似乎相對(duì)穩(wěn)定。另外, 伴隨著645 nm處光吸收強(qiáng)度的快速下降, 582 nm處峰位的吸收值的下降則要緩慢的多。這是由于 582 nm處吸收峰來(lái)自于PXB, 相比于PCB, PXB通過(guò)β50和β61兩個(gè)半胱氨酸殘基與PC-645連接, 而PCB僅靠一個(gè)半胱氨酸殘基與PC-645 β82相連, 所以PXB表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。當(dāng)pH高于10.75時(shí), 各個(gè)吸收峰相互融合為一個(gè)550～640 nm的峰, PC-645的特征吸收峰消失, 表明藻膽素色基所處蛋白內(nèi)部的微環(huán)境構(gòu)象變化, 指示藻藍(lán)蛋白亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)解體[14]。

圖1 pH對(duì)PC-645吸收光譜的影響Fig.1 Effects of solvent pH on the absorption spectra of PC-645

近紫外區(qū)374 nm和340 nm是藻膽素特征吸收峰, 與色基本身的構(gòu)象和狀態(tài)有關(guān)。在pH 3.25～7和pH 7～10.25之間, 374 nm和340 nm處的吸收值略有下降和浮動(dòng), 但變化幅度較小; 而到達(dá)pH 3.25以下或pH 10.25以上時(shí), 兩個(gè)峰的吸收值迅速升高。此結(jié)果說(shuō)明, 藻膽素色基所處的蛋白環(huán)境在 pH 3.25～10.25之間相對(duì)穩(wěn)定, 因而色基狀態(tài)變化有限。而當(dāng)處于極酸和極堿的時(shí)候, 光吸收值的快速增高,可能是因?yàn)镻C-645亞基變性伸展, 處于結(jié)構(gòu)內(nèi)部的藻膽素逐漸暴露, 也可能是因?yàn)閜H變化對(duì)藻膽素產(chǎn)生了不可逆的修飾。此外, 遠(yuǎn)紫外區(qū)屬于芳香族氨基酸的280 nm吸收峰也呈現(xiàn)類(lèi)似的變化趨勢(shì), 由于疏水的芳香族氨基酸通常位于蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水區(qū), 因此其吸收變化也可提示蛋白構(gòu)象變化的信息。

2.2 熒光光譜

圖2 pH對(duì)PC-645熒光發(fā)射譜的影響Fig.2 Effect of pH on fluorescence emission spectra of PC-645

選擇582, 625和645 nm三個(gè)波長(zhǎng)的激發(fā)光分別對(duì)PC-645進(jìn)行激發(fā)。其中582、625 nm是位于β亞基上的PXB和PCB的最大吸收, 而645 nm被認(rèn)為與α亞基上的MBV有關(guān)。在PC-645內(nèi)部, 色基吸收的能量將沿著 PXB→PCB→MBV 方向傳遞, 最終產(chǎn)生660～662 nm 的末端發(fā)射。如圖 2所示, 采用三個(gè)不同波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)PC-645都只產(chǎn)生662 nm特征熒光,pH條件變化, 僅影響發(fā)射的熒光強(qiáng)度, 不影響峰的位置。在pH 3～7范圍內(nèi), 熒光發(fā)射峰強(qiáng)度都隨pH的降低有所降低, 但幅度很小; 當(dāng)pH降低到3時(shí), PC發(fā)射峰強(qiáng)度開(kāi)始驟降; 而pH低于2.5時(shí), 熒光發(fā)射峰幾近消失。在堿性范圍內(nèi), 當(dāng)pH從7逐漸升到 10的過(guò)程中, 熒光強(qiáng)度同樣逐漸降低, 但下降速度明顯快于酸性條件; 當(dāng)pH升高到10.5時(shí),熒光強(qiáng)度可降至 pH7時(shí)的 50%以下。結(jié)合吸收光譜測(cè)定結(jié)果, 說(shuō)明在pH 3.5～10之間時(shí), PC-645不僅結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定, 并且保持了較高的內(nèi)部能量傳遞能力。

2.3 藻藍(lán)蛋白在極端pH下時(shí)間耐受性實(shí)驗(yàn)

圖3 pH3時(shí)PC-645熒光強(qiáng)度(A)與吸收值(B)隨時(shí)間的變化Fig.3 Changes of the relative fluorescence intensity (A)and absorption value (B)of PC-645 with time at pH3

由于隱藻PC-645在pH ＞ 3時(shí)變性緩慢, 而pH ＜ 3時(shí)熒光光譜與吸收光譜都呈快速持續(xù)下降趨勢(shì), 因此選擇pH3條件下, 觀測(cè)PC-645的光譜隨時(shí)間變化。如圖3所示, 在此極端酸性條件下, PC-645的熒光發(fā)射強(qiáng)度在10 min內(nèi)迅速下降, 之后進(jìn)入一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的平臺(tái)期,而吸收峰值在60 min內(nèi)則是呈持續(xù)下降趨勢(shì)。這表明PC-645在 pH3條件下, 其能量傳遞功能的消失和蛋白空間結(jié)構(gòu)的變化并非同步過(guò)程, 能量傳遞功能的失去先于結(jié)構(gòu)變化。因?yàn)閬喕怆x、三級(jí)或者二級(jí)結(jié)構(gòu)解體、色基修飾等結(jié)構(gòu)變化是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程, 過(guò)程中任何一步都可能影響到色基的相對(duì)距離和排布, 導(dǎo)致能量傳遞功能喪失。因此, 為了獲得穩(wěn)定、重復(fù)的光譜測(cè)定結(jié)果, 實(shí)驗(yàn)中變性時(shí)間嚴(yán)格控制為10 min。

2.4 藻藍(lán)蛋白在pH復(fù)性過(guò)程中的吸收光譜

將緩沖液從 pH極端酸性或堿性逐漸調(diào)回中性,PC-645吸收光譜的變化情況如圖 4。結(jié)果顯示,PC-645在pH為3時(shí)盡管吸收強(qiáng)度下降, 但吸收峰形依然保持完整。將pH從3調(diào)整到7后, 吸收峰形并無(wú)改變(圖 4B), 但是強(qiáng)度明顯增加, 可以達(dá)到極高的復(fù)性效率。當(dāng)pH降低到2后, 盡管復(fù)性后的吸收峰形可有一定程度的恢復(fù)(圖 4A), 但強(qiáng)度增加有限,并且出現(xiàn)了675～700 nm的一個(gè)長(zhǎng)波吸收。說(shuō)明pH為 3時(shí), PC-645的大部分蛋白構(gòu)象變化和色基狀態(tài)改變依然是可逆的, 在酸性區(qū)可逆變性和不可逆變性的臨界點(diǎn)可以達(dá)到 3以下, 低于其他藻膽蛋白類(lèi)型[5]。而在堿性范圍內(nèi), 從 pH11或者 pH12恢復(fù)到pH7時(shí), PC-645吸收峰的形狀略有恢復(fù), 但強(qiáng)度沒(méi)有明顯的恢復(fù)(圖4C、圖4D)。表明在極端堿性pH條件下, 僅有局部的蛋白會(huì)發(fā)生復(fù)性, 絕大部分蛋白的變性劇烈, 基本是不可逆的。

3 尿素光譜動(dòng)力學(xué)

3.1 尿素與pH變性比較

通常認(rèn)為, 高質(zhì)量濃度的尿素可使蛋白質(zhì)達(dá)到完全變性[15]。如圖5所示, 當(dāng)用pH為12的堿性尿素變性時(shí), 其效果與單純使用堿性溶液時(shí)結(jié)果相似,在 580～650 nm范圍的吸收大幅下降, 645、625和582 nm吸收峰合并為一個(gè)590～600 nm的吸收單峰,而350～400 nm屬于色基的吸收明顯增加, 并且280 nm芳香族氨基酸的吸收增加。但使用pH2的酸性尿素變性時(shí), 發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白變性程度反而不及單純的酸性條件時(shí)劇烈, 這可能因?yàn)槟蛩匕被馁|(zhì)子化消耗了部分氫質(zhì)子, 延緩了pH降低的效應(yīng)。在含8mol/L尿素、pH為7的中性條件下, PC-645在10 min內(nèi)即可完全變性, 且變性的結(jié)果與堿變性所得的圖譜更為近似。因此, 可見(jiàn)光區(qū)吸收值降低, 特征吸收峰形單峰化, 以及近紫外區(qū)色基吸收明顯增加等光譜特征, 可以看作是藻藍(lán)蛋白完全變性, 亞基構(gòu)象破壞的標(biāo)志。

圖4 pH復(fù)性過(guò)程中PC-645的吸收光譜Fig.4 Absorption spectra of PC-645 in protein refolding induced by pH adjustment

圖5 尿素(8mol/L)在不同pH條件下對(duì)PC-645吸收光譜的影響Fig.5 Influence of urea (8mol/L)on the absorption spectra of PC-645 at different pH

3.2 PC-645的尿素復(fù)性過(guò)程中的吸收光譜

以往有報(bào)道, 尿素導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性的動(dòng)力學(xué)過(guò)程呈現(xiàn)S型, 質(zhì)量濃度高于4 mol/L時(shí), 蛋白變性速度極快[16], 因此實(shí)驗(yàn)選擇 3 mol/L尿素處理PC-645并觀測(cè)其變性過(guò)程的光譜變化。結(jié)果如圖6。

PC-645在尿素中變性的結(jié)果, 只是導(dǎo)致 582、625和645 nm特征吸收峰值下降和350～400 nm色基的吸收的小幅度增加, 但峰形基本不變, 即使變性時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24 h, 也只有645 nm峰降低相對(duì)略快(圖6A)。說(shuō)明低質(zhì)量濃度尿素最初影響的只是PC-645的外部結(jié)構(gòu), 或者亞基的聚合狀態(tài), 而色基所處的內(nèi)部蛋白環(huán)境沒(méi)有被波及, 表現(xiàn)出一定的耐受性。透析除去尿素時(shí), PC-645在最初復(fù)性的1h內(nèi), 特征吸收峰吸收值逐漸增加, 峰形更為完整, 說(shuō)明藻藍(lán)蛋白活性可逐漸恢復(fù)。但時(shí)間更長(zhǎng)以后, 由于透析袋內(nèi)藻藍(lán)蛋白樣品被稀釋, 表觀吸收值反而下降。

4 討論

PC-645作為一種捕光色素蛋白, 其最重要的生理功能就是吸收和傳遞光能。光能的吸收由 PXB、PCB和MBV三種藻膽素色基共同承擔(dān), 它們?cè)诳梢?jiàn)光區(qū)和紫外區(qū)都呈現(xiàn)特征的吸收, 當(dāng)色基所處的蛋白質(zhì)微環(huán)境不同或者發(fā)生變化時(shí), 相同的色基也可產(chǎn)生不同的吸收譜峰。因此吸收光譜的變化是色基所處蛋白質(zhì)內(nèi)環(huán)境變化的探針, 直接反映亞基二、三級(jí)空間結(jié)構(gòu)狀態(tài)。此外, PC-645色基吸收的能量是次第傳遞的, PXB、PCB和MBV任何一種色基激發(fā)后,PC-645在缺少能量受體的情況下都可發(fā)射并且只發(fā)射來(lái)自MBV的660～662nm特征熒光(圖3), 說(shuō)明在PC-645中PXB和PCB都是敏化基團(tuán), 只有MBV是發(fā)色基團(tuán), 此熒光強(qiáng)度的變化直接反應(yīng)能量傳遞效率的高低。由于這些色基分別位于不同亞基上, 要保證能量傳遞功能的實(shí)現(xiàn), 要求蛋白質(zhì)亞基要具備完整的二、三級(jí)甚至四級(jí)結(jié)構(gòu)。因此, 改變環(huán)境條件,綜合觀測(cè)藻藍(lán)蛋白吸收和熒光光譜, 可給出大量的結(jié)構(gòu)與功能信息。

圖6 PC-645在3mol/L尿素中的變性和復(fù)性過(guò)程吸收譜Fig.6 Absorption spectra of PC-645 in 3mol/L urea during denaturation and renaturation

如圖7所示, pH誘導(dǎo)的PC-645蛋白構(gòu)象與功能變化可分為三個(gè)不同的區(qū)段。(1)穩(wěn)定區(qū): 在pH 3.5～7區(qū)域, 吸收和熒光譜都比較穩(wěn)定, 顯示蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能在此區(qū)域都保持正常。(2)次穩(wěn)定區(qū): 在pH在7～10時(shí), 熒光強(qiáng)度緩步下降, 但光吸收依然保持平穩(wěn), 說(shuō)明位于亞基內(nèi)部的色素基團(tuán)的狀態(tài)、所處的疏水微環(huán)境都沒(méi)有改變, 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)大部分完好; 熒光傳遞效率的降低, 可能是亞基局部區(qū)域構(gòu)象變化或者色素基團(tuán)間的空間距離變化(如四級(jí)結(jié)構(gòu)微擾)引起。(3)不穩(wěn)定區(qū): pH在 2.75～3.5和 pH為 10～11時(shí), 吸光度和熒光強(qiáng)度都呈快速下降, 色基在近紫外和可見(jiàn)光區(qū)的吸收峰位變動(dòng), 蛋白構(gòu)象處于快速崩潰期。

圖7 pH對(duì)PC-645吸收光譜、熒光光譜的影響Fig.7 Influence of pH on the traces of peak intensities of absorbance and fluorescence of PC-645

光譜分析結(jié)果說(shuō)明, 藍(lán)隱藻PC-645在酸性范圍比在堿性范圍內(nèi)更穩(wěn)定, 這一點(diǎn)在pH復(fù)性實(shí)驗(yàn)中再次得到證實(shí)(圖4)。這可能與隱藻藻膽蛋白所處的生理環(huán)境特殊有關(guān)。藍(lán)藻藻膽蛋白附著在類(lèi)囊體膜的表面與光合系統(tǒng) II相連接, 紅藻藻膽蛋白附著在類(lèi)囊體膜的外表面, 與葉綠體基質(zhì)相接觸, 而隱藻藻膽蛋白處于類(lèi)囊體腔中。伴隨著光合作用的進(jìn)行, 光驅(qū)動(dòng)電子傳遞的結(jié)果, 使葉綠體基質(zhì)pH升高, 而類(lèi)囊體腔則逐步酸化, 所以對(duì)于隱藻藻膽蛋白而言,在酸性條件下維持結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定具有更為重要的生理意義。

隱藻PC-645在很寬的pH范圍以及一定質(zhì)量濃度的尿素中均保持穩(wěn)定, 表現(xiàn)出構(gòu)象與功能對(duì)環(huán)境變化的高度適應(yīng)性。推測(cè)其亞基間可能存在一些關(guān)鍵位點(diǎn), 在受到一定程度的pH環(huán)境干擾時(shí), 這些位點(diǎn)能夠比較穩(wěn)定的維持蛋白的結(jié)構(gòu)狀態(tài); 而在蛋白結(jié)構(gòu)的一些非關(guān)鍵區(qū)域中, 肽鏈的結(jié)構(gòu)則允許呈現(xiàn)一定的柔性變化而不影響功能的發(fā)揮[17]。隱藻PC-645的兩種 α亞基均含有大量的堿性氨基酸, 其中α1亞基等電點(diǎn)大于 9[18], 說(shuō)明這些堿性殘基大多位于蛋白質(zhì)表面; 而PC-645的β亞基PI為5.7～6.0,偏于酸性。顯然在隱藻PC-645兩種亞基聚合或四級(jí)結(jié)構(gòu)形成中, 除了疏水力之外, 靜電相互作用可能扮演著重要角色。pH變化可影響氨基酸殘基的解離,從而影響如鹽鍵等靜電相互作用而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性;而尿素則既可作為質(zhì)子受體也可作為質(zhì)子供體, 通過(guò)形成氫鍵使蛋白質(zhì)肽鏈伸展[15]。PC-645能在廣泛pH條件下保持能量傳遞功能穩(wěn)定, 并且在低質(zhì)量濃度尿素中維持吸收狀態(tài)較長(zhǎng)時(shí)間不變, 說(shuō)明其亞基結(jié)構(gòu)相當(dāng)致密, 并且四級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。由于PC-645在酸性區(qū)變性的臨界pH在3～3.5附近, 接近羧基側(cè)鏈的解離區(qū)段, 推測(cè)酸性 β亞基上的羧基側(cè)鏈可能參與了亞基之間的關(guān)鍵作用, 當(dāng)環(huán)境 pH低于羧基的pK值時(shí), 大部分羧基質(zhì)子化而失去負(fù)電荷, 導(dǎo)致蛋白空間結(jié)構(gòu)崩潰、解體。

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