郎劍鋒,孔凡彬,石明旺,楊洪生

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

木霉是一類在土壤環(huán)境中普遍存在且具有生防特性的微生物.目前研究證明,木霉可寄生18個屬的29種植物病原菌[1].具有抗逆性強(qiáng)、生長速度快、孢子存活期長、對病原菌具有較強(qiáng)的重寄生作用、對環(huán)境影響小,以及不易使病原菌產(chǎn)生抗性等特點(diǎn),可促進(jìn)植物生長、控制病害發(fā)生.木霉的研究已有很長歷史,早在20世紀(jì)30年代,人們就發(fā)現(xiàn)木霉菌對植物病原菌有拮抗作用.20世紀(jì)70年代以來,國內(nèi)外大量工作者對木霉菌的拮抗作用機(jī)制作了許多深入研究,報道了很多木霉菌作為生防制劑的研究進(jìn)展,證實(shí)了木霉菌對病原菌的多種作用機(jī)制,同時在溫室及田間試驗(yàn)中也取得了較好的效果.Harman等[2]用木霉菌處理水稻種子并接種稻瘟病菌或白葉枯病菌,使水稻幼苗過氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶活性增強(qiáng),在某一時段顯著高于未經(jīng)木霉處理的對照.Trichoderma harzianum的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和水解酶的協(xié)同作用可抑制灰葡萄孢孢子的萌發(fā)[3].木霉菌能有效抑制辣椒白絹病和油菜菌核病病斑增長,控制病菌蔓延,而且促進(jìn)菌核的腐爛,減少菌核形成[4].現(xiàn)在市場上已經(jīng)有不少商品化的木霉制劑,木霉在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中正發(fā)揮出越來越大的作用.

本研究以從土壤上分離到的一株木霉菌,測定其對7種植物病原菌的抑制作用,明確哈茨木霉對病原菌的作用機(jī)制,以期為今后生防制劑的制備打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用哈茨木霉Trichoderma harzianum及7種植物病原菌小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis、玉米紋枯病菌Rhizoctonia spp.、西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium、水稻紋枯病菌Rhizoctorzia solani、蒜苔炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.、水稻惡苗病菌Fusarium moniliforme Sheld、小麥根腐病菌Bipolaris shoemaker均由河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 哈茨木霉對7種病原菌的抑菌作用 試驗(yàn)采用對峙培養(yǎng)方法[5],活化好的各供試病原菌和供試哈茨木霉菌置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d.用打孔器（D=5 mm）沿菌落邊緣打菌餅（打過不同菌種后用乙醇清洗打孔器,酒精燈火焰灼燒,降至室溫）.用接種針將木霉菌與病原菌菌餅分別接種于PDA平板培養(yǎng)基距離中心1 cm處同一直線上的兩點(diǎn)上,每皿1個病原菌菌餅和1個木霉菌菌餅.同時設(shè)只接病原菌和哈茨木霉菌的平板作為對照,每處理重復(fù)3次[6-7].28℃恒溫培養(yǎng),逐日觀察菌落的生長和哈茨木霉菌抑制作用效果,測量處理病原菌和對照病原菌菌落半徑,計算抑制率.抑制率的計算公式為：

接菌方法與測量時間根據(jù)病原菌菌絲生長速度確定.木霉菌絲生長較快,部分病原菌菌絲生長較慢.水稻惡苗病菌、水稻紋枯病菌、西瓜枯萎病菌、蒜苔炭疽病菌、小麥根腐病菌為先接種病原菌,待3 d后接種木霉拮抗菌,第5天測量菌落大??；小麥紋枯病菌與木霉菌同時接種,第3天測量菌落大小.接種病原菌為生長旺盛的菌株,木霉為生長2 d的菌株.

1.2.2 木霉菌絲提取物對7種病原菌的抑菌作用 取實(shí)驗(yàn)室PDA培養(yǎng)基28℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d的木霉菌株1皿,用50 m L無菌水浸泡洗下菌絲體.浸泡3 h后將液體分裝入離心管,離心得到其粗提液.粗提液用細(xì)菌過濾器過濾后,即為木霉菌絲提取物.將提取物加入PDA培養(yǎng)基混勻（按照提取液∶PDA培養(yǎng)基=1∶9比例）,即為含木霉菌絲提取物培養(yǎng)基.培養(yǎng)基倒為平板,待冷卻硬化后接種直徑為0.5 mm病原菌菌餅,以加無菌水培養(yǎng)基的平板為對照（無菌水∶PDA培養(yǎng)基=1∶9）,3次重復(fù).置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),逐日觀察菌落直徑,連續(xù)觀察3 d,計算抑制率[8].

1.2.3 哈茨木霉對小麥紋枯病菌重寄生作用的觀察 在PDA培養(yǎng)基中央放置1塊20 mm×20 mm無菌蓋玻片.在左側(cè)距蓋玻片40 mm處接種木霉菌,右側(cè)距蓋玻片20 mm處接種病原真菌.28℃恒溫培養(yǎng),

逐日觀察.待木霉菌絲與病原菌菌絲相接觸后取下蓋玻片,倒扣于載玻片上,在光學(xué)顯微鏡下觀察木霉菌與病原菌的菌絲體作用方式[9].

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉對7種病原菌的抑菌作用

哈茨木霉對7種植物病原菌的抑菌效果見表1.

由表1可知,哈茨木霉對表中7種病原菌均有抑制作用,其中對西瓜枯萎病菌的抑制率最高,可達(dá)44.3%；對水稻惡苗病菌抑制率次之,為41.2%；對玉米紋枯病菌抑制率為40%；對小麥根腐病菌抑制率最低,為13.4%.

表1 哈茨木霉對7種病原菌的抑菌作用Tab.1 Inhibition of Trichoderma harzianum on seven pathogens

哈茨木霉與病原菌平板對峙過程中,哈茨木霉菌絲迅速擴(kuò)展,包圍病原菌菌落,占領(lǐng)生存空間,與病原菌菌絲接觸后強(qiáng)烈抑制病原菌的菌絲生長,病原菌菌絲停止生長且菌絲變黃褐色,供試病原菌的菌落逐漸被哈茨木霉菌落覆蓋,哈茨木霉菌絲擴(kuò)展至全皿,并在病原菌菌落上產(chǎn)生大量綠色分生孢子.

2.2 哈茨木霉菌絲提取物對7種病原菌的抑菌作用

哈茨木霉菌絲提取物對7種植物病原菌的抑菌效果見表2.

表2 哈茨木霉菌絲提取物對7種病原菌的抑菌作用Tab.2 Inhibition of mycelia extract of Trichoderma harzianum on seven pathogens

由表2可知,哈茨木霉菌絲提取物對7種病原菌均有抑制作用,其中對水稻惡苗病菌抑制效果最為明顯,對小麥根腐病菌抑制效果次之,對小麥紋枯病菌抑制效果較差.數(shù)據(jù)表明木霉菌絲中含有可以抑制病原菌生長的物質(zhì),但是對不同病原菌的作用效果不同.

2.3 哈茨木霉對小麥紋枯病菌重寄生作用的觀察

哈茨木霉對小麥紋枯病菌重寄生作用的光學(xué)顯微觀察結(jié)果見圖1.

圖1 哈茨木霉菌絲與病原菌菌絲作用方式Fig.1 Mode action of mycelia of Trichoderma harzianum against Rhizoctonia cerealis

由圖1可知,顯微鏡下觀察到哈茨木霉菌絲與小麥紋枯病菌菌絲接觸后,哈茨木霉菌菌絲以纏繞、穿插、緊貼等方式寄生在小麥紋枯病菌菌絲上（見圖1中箭頭所指的圓圈處所示）,使得病原菌的菌絲變形,同時產(chǎn)生分生孢子,木霉菌絲通過侵入到病原菌的菌絲內(nèi)吸收其營養(yǎng),造成病原菌菌絲的斷裂、解體.

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)研究了哈茨木霉對7種病原菌的拮抗作用機(jī)制,試驗(yàn)結(jié)果表明,木霉對該7種病原菌均有不同程度的抑制作用.對大多數(shù)病原菌的抑制率能達(dá)到25%以上,對西瓜枯萎病菌的平均抑制率最高,可達(dá)44.3%.木霉菌絲粗提物對病原菌的生長具有一定的抑制作用,但普遍抑制率較低.哈茨木霉菌對病原菌的作用方式之一是爭奪營養(yǎng)和生長空間.木霉菌較病原菌對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng),且生命力頑強(qiáng),生長速度更快,能夠快速搶占生長的空間,利用病原菌菌絲體營養(yǎng)物質(zhì)作為起點(diǎn),吸收營養(yǎng),從而搶占病原菌的入侵位點(diǎn),阻礙病原菌的發(fā)展蔓延.由木霉與小麥紋枯病菌的相互作用發(fā)現(xiàn),木霉的菌絲發(fā)達(dá),可以纏繞到病原菌菌絲上,吸取病原菌體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì),對病原菌形成重寄生作用,分解病原菌,致使病原寄主死亡,這和以往的研究結(jié)果是一致的[8-10].此株木霉抑菌具有廣譜性,能對多種病原菌產(chǎn)生作用,是一種理想的、難得的生防資源.后期可對其進(jìn)行誘變選育,試驗(yàn)其在田間應(yīng)用情況和是否可以誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性.

[1]胡瓊.木霉對植物促生作用的研究進(jìn)展[J].北方園藝,2010（7）：197-200.

[2]Harman G E,Howell C R,Viterbo A,et al.Trichoderma species-opportunistic,avirulent plant symbionts[J].Nature Reviews Micobiology,2004,2：43-56.

[3]Howell C R.Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control ofplant diseases：the history and evolution of current concepts[J].Plant Disease,2003,87（1）：4-10.

[4]姚元枝.木霉菌防治油菜菌核病和辣椒白絹病的研究[J].懷化師專學(xué)報,1997,16（6）：67-69.

[5]王偉東,高亞梅.哈茨木霉對幾種病原菌的拮抗作用及液體產(chǎn)孢培養(yǎng)條件的研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報,2010,22（6）：4-8.

[6]袁佐清.土壤中木霉的分離純化以及對植物病原真菌的拮抗研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2006,15（5）：132-135.

[7]張風(fēng)革.木霉對土傳病害的生防機(jī)制及其應(yīng)用前景[J].吉林農(nóng)業(yè),2009（8）：68.

[8]宋曉妍,陳秀蘭.棉花黃萎病菌拮抗木霉的篩選及其抑菌機(jī)制的研究[J].山東大學(xué)學(xué)報,2005,40（6）：98-102.

[9]滕安娜.生防木霉拮抗黃瓜枯萎病菌的初步研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2010（1）：159.

[10]管懷驥,陳莉.哈茨木霉TH-1菌株對小麥紋枯病的控制效果研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),201l,39（16）：9664-9665.