段玉敏 張洪娟

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 150036）

1 材料與方法

1.1 藥物

獨(dú)角蓮乙醇提取物由黑龍江省中醫(yī)研究院中藥所提供。

注射用環(huán)磷酰，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：20100831

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：Scxk(吉)2007-0003

1.3 瘤株

肉瘤S180由黑龍江省腫瘤研究所提供。

1.4 主要儀器與試劑

超凈工作臺(tái)；酶標(biāo)儀；顯微鏡；離心機(jī) ；lsever抗凝液；都氏試劑；羊頸靜脈血由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；豚鼠血清，用前生理鹽水1：10稀釋。

1.5 方法

實(shí)驗(yàn)用荷瘤小鼠均按常規(guī)方法接種腫瘤細(xì)胞。接種次日，隨機(jī)分為5組，每組30只，另設(shè)空白對(duì)照組。均為ig給藥，每天1次。每組取10只鼠給藥10天后停藥，尾靜脈注射1：4稀釋的印度墨汁，0.1mL/10g體重；在注入印度墨汁后1min和11min分別用毛細(xì)管從小鼠眼內(nèi)靜脈叢取血25ul，用0.1%Na2CO3溶液2 mL稀釋；以0.1%Na2CO3溶液2mL調(diào)零點(diǎn)后，將待測(cè)樣品放入酶標(biāo)儀中,于650nm波長(zhǎng)處測(cè)出OD值,頸椎脫臼處死小鼠，稱取體重，取胸腺、肝、脾稱重，并計(jì)算矯正吞噬指數(shù)。每組再取10只鼠，給3次藥后腹腔注射綿羊紅細(xì)胞懸液0.2mL/每鼠，進(jìn)行免疫，繼續(xù)給藥6日后，眼眶取血2500rpm離心10min，分離血清。樣品管中加入300倍稀釋血清1mL、0.5mL綿羊紅細(xì)胞稀釋液、1：10的豚鼠血清稀釋液1mL；對(duì)照管中加入1mL生理鹽水、0.5mL綿羊紅細(xì)胞稀釋液、1：10的豚鼠血清稀釋液1mL。將各管置37℃水浴中保溫10分鐘，冰浴終止反應(yīng)后2000rpm離心10分鐘取上清液1mL、都氏液3mL于試管中，同時(shí)取0.25mL綿羊紅細(xì)胞稀釋液、都氏液4mL于另一支試管中靜止10min，于酶標(biāo)儀中540nm處測(cè)各管的吸光度[2]。每組剩余鼠給藥10天，眼眶取血2500rpm離心10min，分離血清采用放免法檢測(cè)IL-2、TNF-α含量，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)S180荷瘤鼠免疫功能的影響

表1 獨(dú)角蓮對(duì)S180荷瘤小鼠吞噬功能、溶血素及胸脾指數(shù)的影響(±S，n=10)

表1 獨(dú)角蓮對(duì)S180荷瘤小鼠吞噬功能、溶血素及胸脾指數(shù)的影響(±S，n=10)

與模型組比較**P＜0.01， 與空白組比較 ▲P＜0.05

組別 劑量g/kg脾指數(shù)mg/10g胸腺指數(shù)mg/10g矯正吞噬指數(shù)OD 溶血素IC50空白對(duì)照 —— 73.21±13.52 23.43±6.21 6.46±1.28 201.14±43.52模型對(duì)照 —— 95.67±22.38 15.29±4.14 4.13±0.83▲ 129.54±28.96▲獨(dú)角蓮高 1.6 75.06±17.27*22.69±6.15*6.58±1.39* 184.85±31.26*獨(dú)角蓮中 0.8 78.43±16.25*21.51±5.33*6.06±1.27* 177.42±29.18*獨(dú)角蓮低 0.4 80.64±20.82 17.83±5.29 5.13±1.71 149.37±21.06環(huán)磷酰胺 0.003 60.35±15.14* 6.95±2.18*3.89±0.62▲ 131.85±30.62

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組、環(huán)磷酰胺組荷瘤鼠矯正的吞噬指數(shù)、胸脾指數(shù)均低于正常組P＜0.05；獨(dú)角蓮高、中、低劑量組矯正的吞噬指數(shù)、胸脾指數(shù)與空白對(duì)照組無明顯差異P＞0.05，明顯高于模型組P＜0.01。表明獨(dú)角蓮具有顯著提高機(jī)體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能。

2.2 對(duì)S180荷瘤鼠血清中溶血素、IL-2、TNF-α的影響

表2 獨(dú)角蓮對(duì)S180荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α的影響(±S，n=10)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組荷瘤鼠外周血TNF-α、IL-2含量明顯低于空白組水平但無明顯差異P＞0.05。獨(dú)角蓮高、中劑量組小鼠外周血TNF-α、IL-2含量明顯高于模型組，與模型組比均具有顯著性差異P＜0.05；與空白組水平相當(dāng)。

3 討論

癌組織由機(jī)體本身組織演變而來，基本上不產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激性物質(zhì)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)其有一定的相容性，免疫功能的破壞使腫瘤能夠通過多種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，因此誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答、激活和恢復(fù)機(jī)體的免疫功能防止腫瘤細(xì)胞免疫逃逸是提高腫瘤患者生活質(zhì)量、有效延長(zhǎng)生命的關(guān)鍵所在。目前，中草藥及其活性成分的抗腫瘤作用研究已成為腫瘤研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者分別對(duì)中藥直接抗腫瘤、通過免疫途徑或作為抗腫瘤藥物的增效劑而發(fā)揮間接抗腫瘤作用進(jìn)行了多層面、多靶點(diǎn)的廣泛研究[2]。本課題組通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)對(duì)獨(dú)角蓮乙醇提取物進(jìn)行抗腫瘤作用研究并取得很好抑瘤效果[3,4]。本實(shí)驗(yàn)通過以肉瘤S180荷瘤小鼠為模型的免疫功能影響研究表明，獨(dú)角蓮能明顯提高吞噬細(xì)胞的功能，對(duì)綿羊紅細(xì)胞所致小鼠特異性抗體溶血素的生成則有增強(qiáng)作用，能促進(jìn)免疫因子的生成是荷瘤機(jī)體恢復(fù)免疫功能，從而揭示該藥即具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用又有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的兩效合一作用，為新藥注冊(cè)和臨床有效性提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 熊靜帆,等.深圳市1999-2004年惡性腫瘤發(fā)病趨勢(shì)分析[J],中華流行病學(xué)雜志.2006,13(8)：572-576

[2] 張靜,等.中藥抗腫瘤的免疫學(xué)調(diào)節(jié)作用和作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2006，22(6),386-387

[3] 張洪娟,等.獨(dú)角蓮不同工藝提取物體內(nèi)抗腫瘤活性研究[J].中草藥,2008,39,84-86

[4] 段玉敏,等.獨(dú)角蓮乙醇提取物體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2010,38(3),45-47