陳荷蓮，黃 璐，鄭 琦

（江漢大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056）

己烯雌酚（DES）［1］是一種人工合成的非甾體雌激素類物質(zhì)，藥理性質(zhì)與天然雌二醇相似，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，增加蛋白質(zhì)沉積，減少脂肪沉積等功效；它能促進(jìn)畜牧動物生長、增加瘦肉率、提高肉料比等。但實(shí)踐表明，DES對人體具有很強(qiáng)的毒副作用，如改變機(jī)體遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致基因突變，促使細(xì)胞癌變。因此，自1979年起包括我國在內(nèi)的世界各國開始嚴(yán)格控制DES作為治療藥物的使用，并禁止用作動物飼料添加劑。但由于利益的驅(qū)動，一些不法商人仍然違規(guī)濫用。為保護(hù)人類健康，動物性食品中DES殘留的檢測顯得尤為重要，文獻(xiàn)報道的DES檢測方法主要有：高效液相色譜法、氣相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［2-4］、酶聯(lián)免疫分析法、電化學(xué)法等［5］，這些方法要么對儀器要求較高，要么對試劑要求較高，其推廣和應(yīng)用受到一定限制。筆者利用DES具有還原性特性，探索了由三甲基十六烷基溴化銨（CTMAB）、Fe（Ⅱ）、K3［Fe（CN）6］等組成的多元絡(luò)合體系［6］為探針的用可見分光光度法測試DES的新方法。該方法所要求儀器普通，試劑常規(guī)，一般實(shí)驗(yàn)室條件都能滿足。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DES，阿拉丁試劑公司，99%標(biāo)準(zhǔn)品；乙腈，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR；HCl，信陽市化學(xué)試劑廠，AR；NaOH，天津市大陸化學(xué)試劑廠，AR；CTMAB，BDH Chemicals Ltd.Poole（Eng?land），98%標(biāo)準(zhǔn)品；K3［Fe（CN）6］、FeCl3，天津市福晨化學(xué)試劑廠，AR；配溶液所用水為二次蒸餾水；奶粉，購自超市。

BF-2000型N2吹干儀，北京八方世紀(jì)有限公司；UV-2550雙光束紫外可見分光光度計，日本島津公司；800型低速離心沉淀機(jī)、HH-2數(shù)顯性恒溫水浴鍋，國華儀器；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Q-250超聲波提取儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法與步驟

1.2.1 溶液配制 DES儲備液：電子天平準(zhǔn)確稱量0.0514 g的DES，用乙腈溶解并稀釋至50 mL，得濃度為1.0177 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。實(shí)驗(yàn)時用乙腈稀釋至8.14 μg/mL。

FeCl3溶液：準(zhǔn)確稱取1.0100 g FeCl3，蒸餾水溶解并稀釋至250 mL，其間用濃HCl調(diào)溶液pH在1.0～1.5之間，得濃度為1.5×10-2mol/L儲備液。實(shí)驗(yàn)時用蒸餾水稀釋到所需濃度。

K3［Fe（CN）6］溶液：準(zhǔn)確稱取1.2300 g K3［Fe（CN）6］，用蒸餾水溶解并稀釋至250 mL，得濃度為1.5×10-2mol/L儲備液。實(shí)驗(yàn)時用蒸餾水稀釋到所需濃度。

CTMAB溶液：用電子天平準(zhǔn)確稱量0.1016 g CTMAB，用蒸餾水溶解并稀釋至100 mL，得濃度為2.79×10-3mol/L CTMAB溶液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 準(zhǔn)確移取1.5×10-3mol/L FeCl3溶液2.0 mL和CTMAB 200 μL于10 mL比色管中，搖勻；在10 min內(nèi)分批加入適量的DES標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液，用HCl調(diào)pH值到3.0，30℃下反應(yīng)10 min；最后加入1.5×10-3mol/L K［3Fe（CN）6］溶液2.0 mL，搖勻，40℃下反應(yīng)40 min；用二次蒸餾水定容到10 mL，搖勻，以試劑空白為參比，用2 cm的比色皿于736 nm處測定其吸光度［1］。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收光譜

按1.2.2實(shí)驗(yàn)方法配制溶液繪制其吸收光譜，以乙腈為參比測得DES溶液吸收光譜，以水為參比測得FeCl3溶液、K3［Fe（CN）6］溶液吸收光譜，以試劑空白為參比，測得反應(yīng)生成的多元絡(luò)合物的吸收光譜，掃描區(qū)間在300～900 nm（圖1）。

圖1 物質(zhì)吸收光譜

如圖1所示，DES、FeCl3和K3［Fe（CN）6］在可見光區(qū)幾乎沒有吸收，反應(yīng)生成的多元絡(luò)合體系在700～800 nm范圍內(nèi)有明顯吸收，體系的最大吸收波長在736 nm處，故選擇測定吸光度的波長為736 nm。

2.2 條件的選擇

2.2.1 酸堿度的影響 按實(shí)驗(yàn)1.2.2的方法，在加入DES后調(diào)節(jié)體系的pH值分別為1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0，試劑空白做參比，測吸光度值（表1）。

由表1可知，pH值為3.0時有最大的吸光度值，故加入DES后調(diào)整體系pH值為3.0。分析原因：當(dāng)體系pH值超過3.0時，溶液中的Fe（Ⅲ）以Fe（OH）3沉淀析出，殘存于體系中Fe（Ⅲ）太少，影響了與DES的反應(yīng)，pH值為3.0時能保證體系中的Fe（Ⅲ）濃度最高，與DES的相互作用更充分、完全，為后續(xù)的絡(luò)合體系提供更多Fe（Ⅱ）。

2.2.2 反應(yīng)時間 依據(jù)1.2.2的實(shí)驗(yàn)步驟，F(xiàn)eCl3溶液中加入一定量DES后，控制反應(yīng)時間分別為10、20、30、50 min，然后加入K［3Fe（CN）6］溶液，反應(yīng)40 min，試劑空白做參比，測吸光度（圖2）。

圖2 時間對吸光度的影響

由圖2可見，隨著反應(yīng)時間的延長，測得的吸光度減小，反應(yīng)時間為10 min有最大的吸光度，故加入DES后反應(yīng)時間定為10 min。

同樣方法，改變加入K［3Fe（CN）6］溶液后的反應(yīng)時間，結(jié)果表明，反應(yīng)時間為40 min有最大吸光度，故反應(yīng)時間定為40 min。

2.2.3 反應(yīng)溫度的影響 依據(jù)1.2.2的實(shí)驗(yàn)步驟，考察了溫度對體系吸光度的影響。FeCl3溶液中加入一定量DES后，控制反應(yīng)溫度分別為30℃（室溫）、40℃、50℃、60℃，反應(yīng)10 min，然后加入K［3Fe（CN）6］溶液，反應(yīng)40 min，后用試劑空白做參比，測吸光度（圖3）。

圖3 體系反應(yīng)溫度對吸光度的影響

由圖3可知，隨溫度的升高測得的A值減小，溫度為30℃時有最大的吸光度，故實(shí)驗(yàn)時加入DES后反應(yīng)時的溫度定為30℃。

同樣方法，改變加入K3［Fe（CN）6］溶液后的反應(yīng)的溫度，結(jié)果表明，溫度為40℃時有最大的吸光度，故反應(yīng)溫度定為40℃。

2.2.4 FeCl3、K3［Fe（CN）6］溶液用量的影響依據(jù)1.2.2的實(shí)驗(yàn)步驟，考察了FeCl3用量對體系吸光度的影響。固定 DES、CTMAB、K3［Fe（CN）6］溶液用量，改變FeCl3用量，設(shè)定FeCl3溶液的加入量為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、3.0 mL，試劑空白做參比，在選定波長下測吸光度，其結(jié)果如圖4。

圖4 FeCl3溶液用量對吸光度的影響

如圖4所示，當(dāng)FeCl3加入量小于2 mL時，隨著FeCl3加入量增加，吸光度逐漸增大，超過2 mL后吸光度隨FeCl3加入量增大而減小，因此實(shí)驗(yàn)中將FeCl3溶液用量定為2.0 mL。

同樣方法只改變K［3Fe（CN）6］用量，固定其他各試劑加入量不變，K［3Fe（CN）6］溶液加入量為2.0 mL時有最大的吸光度，因此實(shí)驗(yàn)中K［3Fe（CN）6］溶液用量定為2.0 mL。

2.2.5 CTMAB用量和加入順序的影響 按照1.2.2實(shí)驗(yàn)方法，考察了CTMAB加入量對體系吸光度的影響。固定DES、FeCl3、K［3Fe（CN）6］溶液用量，改變CTMAB用量，設(shè)定CTMAB溶液的加入量為0、100、200、400、600 μL，試劑空白做參比，在選定波長下測吸光度（圖5）。

如圖5所示，體系加入CTMAB后吸光度增大，且最大吸收波長發(fā)生紅移。當(dāng)CTMAB溶液加入量大于100 μL后，體系的吸光度沒有明顯的增大，加入量在200～400 μL之間體系的吸光度和紅移值幾乎相同沒有明顯變化，當(dāng)加入量到600 μL時，吸光度明顯降低，因此實(shí)驗(yàn)中TMAB溶液用量定為200 μL。

圖5 CTMAB用量對吸光度的影響

CTMAB在本體系中起著增溶增敏作用，其機(jī)理是：①表面活性劑的陽離子和顯色劑的絡(luò)陰離子形成離子對，會形成長鏈銨膠束，增加其離解度，使溶液最大吸收紅移。②季銨鹽膠束的形成可起分散劑的作用，使這些離子對發(fā)生膠束增溶作用，使較多的顯色絡(luò)合物質(zhì)點(diǎn)保持在水相，同時使光的吸收增大。③季銨鹽的存在，使金屬和有機(jī)配位體形成高配位數(shù)的絡(luò)合物，靈敏度增加。

依據(jù)1.2.2實(shí)驗(yàn)方法，固定DES、CTMAB、FeCl3、K3［Fe（CN）6］溶液用量不變，改變各溶液加入的先后順序，測體系摩爾吸光系數(shù)ε值。分別以如下的各試劑加入先后順序做實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)表明，（1）的ε值最大，至少是其他組的1.2倍，故各試劑加入先后順序應(yīng)按（1）的順序加。CTMAB在（1）中能使FeCl3與DES之間的相互接觸更充分，反應(yīng)更完全，具有相轉(zhuǎn)移催化作用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

依據(jù)1.2.2實(shí)驗(yàn)方法，準(zhǔn)確加入不同體積的DES，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖6）。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

DES的質(zhì)量濃度在0.03256～0.6521 μg/mL范圍內(nèi)符合比爾定律，線性回歸方程為A=0.0027+0.3990 ρ（μg/mL），相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。

根據(jù)線性回歸方程計算出DES摩爾吸光系數(shù)ε=5.43×105L/（mol·cm）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，平行測定11份空白溶液，按照空白測得值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍除以工作曲線擬合方程斜率，求出其檢出限為1.35 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.89%。

2.4 樣品分析

準(zhǔn)確稱取2.0 g奶粉試樣于10 mL具塞刻度離心管中，加4.0 mL乙腈混勻，超聲提取20 min，后以4000 r/min離心10 min，取上清液靜置，重復(fù)3次，合并上清液，40℃下用N2吹干，殘余物用乙腈溶解并定容至2 mL，用于實(shí)驗(yàn)檢測。

用空白奶粉試樣進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，精密稱取樣品2.0 g，添加濃度為1.5 μg/mL DES標(biāo)準(zhǔn)液。按1.2.2實(shí)驗(yàn)方法測定空白和加標(biāo)樣品在736 nm處的吸光度，計算其回收率。測3次取平均值，回收率在89.3%～101.6%。

3 結(jié)論

利用DES具有將Fe（Ⅲ）還原成Fe（Ⅱ）的特性，探索了由CTMAB、Fe（Ⅱ）、K3［Fe（CN）6］等組成的多元絡(luò)合體系為探針的可見分光光度法測試DES的新方法。實(shí)驗(yàn)表明DES的質(zhì)量濃度在0.03256～0.6521 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程 A=0.0027+0.3990ρ（μg/mL），相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，摩爾吸光系數(shù)ε=5.43×105L/（mol·cm）。CTMAB在該分析方法中具有催化和增敏作用。在對奶粉樣品的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，回收率為89.3%～101.6%。

［1］羅板鑫，陳昌云.一種簡單快速的己烯雌酚定性檢測方法研究［J］.中國教育技術(shù)裝備，2012（6）：126-127.

［2］杜志峰，黃金鳳.動物肌肉組織中己烯雌酚殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定［J］.分析測試學(xué)報，2007，26（6）：823-826.

［3］祝偉霞，劉亞風(fēng)，袁萍，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定嬰幼兒配方奶粉中39種激素殘留量［J］.色譜，2010，28（11）：1031-1037.

［4］潘自紅，馬丹丹，李子賀，等.FeCl3-鐵氰化鉀體系分光光度法測定酚磺乙胺［J］.分析試驗(yàn)室，2013，32（1）：111-113.

［5］王瑤，周建華.食品中己烯雌酚的檢測方法［J］.食品工業(yè)科技，2012，2（33）：373-375.

［6］張建華，張水鳳.吸收光譜線型分析用于十六烷基溴化銨臨界膠束濃度的測量［J］.應(yīng)用化學(xué)，2007，24（3）：306-309.