劉 駿, 周建獎,2△, 趙 艷, 謝 淵

(貴陽醫(yī)學院 1分子生物學重點實驗室， 2附屬醫(yī)院檢驗科， 貴州 貴陽550004)

·短篇論著·

胃泌素促進胃癌細胞的遷移和侵襲*

劉 駿1, 周建獎1,2△, 趙 艷1, 謝 淵1

(貴陽醫(yī)學院1分子生物學重點實驗室，2附屬醫(yī)院檢驗科， 貴州 貴陽550004)

目的研究胃泌素在胃癌細胞遷移和侵襲中的作用。方法用細胞劃痕實驗、Transwell小室遷移和侵襲實驗檢測10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理后胃癌細胞AGS和SGC-7901遷移和侵襲能力的變化， MTT法檢測細胞增殖能力， ELISA法檢測細胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP- 2)的含量。結(jié)果10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理胃癌細胞后，細胞遷移和侵襲能力增強。對照組、10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素組AGS細胞平均遷移數(shù)分別為56.0、88.1和106.4 /view，SGC-7901細胞平均遷移數(shù)分別為52.8、91.0和113.3 /view， AGS細胞平均侵襲數(shù)分別為78.4、118.7和141.6 /view，SGC-7901細胞平均侵襲數(shù)分別為87.3、124.6和147.4/view(均P<0.01)；100 nmol/L胃泌素組細胞遷移和侵襲能力均高于10 nmol/L組(P<0.05)；胃泌素處理后細胞的增殖率及MMP- 2的分泌量也顯著增加(P<0.05)。結(jié)論胃泌素通過促進MMP- 2的分泌以劑量依賴的方式增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力，可能是體內(nèi)胃癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機制之一。

胃泌素； 胃腫瘤； 基質(zhì)金屬蛋白酶2

胃癌是嚴重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，其致死率居全球所有惡性腫瘤死亡的第2位[1]。迄今為止，胃癌的發(fā)病機制尚不清楚，近年的研究表明，胃癌的發(fā)生與胃腸道激素的表達異常有關(guān)，胃泌素(gastrin)即為其中重要的一種。胃泌素是一種胃腸肽激素，具有促進胃酸分泌等生理功能。但是近年的研究發(fā)現(xiàn)，病理情況下胃泌素能促進胃腸癌、胰腺癌及肝癌等胃腸道惡性腫瘤細胞的增殖[2- 4]，從而提出胃腸道腫瘤與胃泌素自分泌環(huán)假說密切相關(guān)，即胃腸道腫瘤細胞既能分泌胃泌素，又能表達胃泌素受體(又稱為膽囊收縮素B受體，cholecystokinin B receptor，CCKB受體)，胃泌素與細胞膜上的CCKB受體結(jié)合后，促進胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。但是目前胃泌素與胃癌的研究主要集中在細胞的增殖方面，與胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未見報道。本研究用不同濃度的胃泌素處理胃癌細胞，研究胃泌素對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，為胃癌轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

人胃癌細胞株AGS(ATCC: CRL-1739TM)和SGC-7901由本實驗室保存；人胃泌素(human gastrin-17，G-17)和MTT(Sigma)；基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)ELISA試劑盒和基質(zhì)膠(R&D)；Transwell小室(Corning)；胎牛血清(Gibco)；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基和雙抗(HyClone);DMSO(Ruitaibio)；RT-PCR試劑盒(天根生物)；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)及胃泌素處理 人胃癌細胞株AGS和SGC-7901分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。分別用終濃度為10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理細胞，培養(yǎng)6～8 d后備用，所有實驗均以未經(jīng)胃泌素處理的細胞為對照組。

2.2細胞劃痕實驗 于12 孔培養(yǎng)板中接種上述細胞，細胞數(shù)為5×105cells/well，過夜培養(yǎng)。細胞鋪滿后，用細胞刮通過孔中心劃一條寬度相等的橫行細胞刮除帶，吸掉含有刮除細胞的培養(yǎng)液，分別加入含終濃度為10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素的培養(yǎng)液400 μL/well，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，于0 h和培養(yǎng)24 h后倒置顯微鏡下拍照，實驗重復(fù)3次。

2.3Transwell小室細胞侵襲實驗 預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液以1∶6體積稀釋液態(tài)基質(zhì)膠，于24孔培養(yǎng)板中Transwell小室的上室加稀釋后基質(zhì)膠40 μL，37 ℃孵育6 h。吸盡基質(zhì)膠表面的液體，加入70 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，37 ℃孵育30 min。用含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋細胞到108～109cells/L。上室中加入200 μL稀釋后的細胞，下室加含30%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液600 μL，并于上、下室內(nèi)加胃泌素，使之終濃度分別為10 nmol/L和100 nmol/L。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，擦掉上室中基質(zhì)膠上的細胞，用1%PBS洗滌3遍，將小室置于4%多聚甲醛中固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，洗滌3遍，顯微鏡下隨機選取10個視野，在400倍下計數(shù)侵襲到下室的細胞數(shù)，計算每個視野的平均侵襲細胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2.4Transwel小室細胞遷移實驗 Transwell小室遷移實驗除上室中不加基質(zhì)膠、細胞懸液的密度為107～108cells/L、下室中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液外，其余方法同Transwell小室侵襲實驗，最后計算平均遷移細胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2.5MTT實驗 96孔培養(yǎng)板中接種細胞5 000 cells/well，加入胃泌素，使之終濃度為10 nmol/L和100 nmol/L，設(shè)8個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀測A570，計算細胞的相對增殖率，相對增殖率(%)=A570實驗組/A570對照組×100%。

2.6ELISA實驗 用10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理細胞，于收集上清液前12 h換成僅含胃泌素而不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，上清液離心后用Bradford定量蛋白濃度， ELISA試劑盒檢測MMP- 2含量，按說明書操作。

3統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1胃泌素對胃癌細胞增殖能力的影響

如圖1所示， 10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理AGS和SGC-7901細胞后，細胞的增殖能力顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2胃泌素對胃癌細胞遷移能力的影響

用10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理AGS和SGC-7901細胞后，細胞的遷移速度快于對照組，見圖2。遷移到Transwell下室的細胞數(shù)也多于對照組,結(jié)晶紫染色計數(shù)結(jié)果顯示10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理組的平均遷移細胞數(shù)高于對照組 (P<0.01)， 100 nmol/L處理組也高于10 nmol/L處理組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 1. The proliferation rates of AGS and SGC-7901 cells determined by MTT assay. Mean±SD.n=8.**P<0.01vs0 nmol/L.

圖1MTT法檢測AGS和SGC-7901細胞的增殖率

Figure 2. The migration of SGC-7901 and AGS cells after gastrin treatment determined by wound-healing assay (×100).

圖2細胞劃痕實驗檢測胃泌素處理后SGC-7901和AGS細胞的遷移

3胃泌素對胃癌細胞侵襲能力的影響

用10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理AGS和SGC-7901細胞后，穿透Transwell上室基質(zhì)膠及聚碳酸酯膜，侵襲到下室的細胞數(shù)顯著高于對照組細胞(P<0.01)，且隨胃泌素濃度的增加，侵襲細胞數(shù)也增加 (P<0.05)，見圖4。

Figure 3. The migration of SGC-7901 and AGS cells after gastrin treatment determined by Transwell assay (crystal violet staining，×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 nmol/L;##P<0.05vs10 nmol/L.

圖3Transwell小室實驗檢測胃泌素處理后SGC-7901和AGS細胞的遷移及其細胞計數(shù)結(jié)果

4胃泌素增加胃癌細胞MMP-2分泌

10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理AGS和SGC-7901細胞后，培養(yǎng)上清液中MMP- 2濃度高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

討 論

胃癌轉(zhuǎn)移是影響患者療效和預(yù)后的關(guān)鍵因素，亦是導致胃癌患者死亡的主要原因，而胃泌素與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。有研究證實胃泌素的表達隨著腫瘤分化程度的降低而顯著增多，從而促進腫瘤細胞的生長，并與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性[2-5]。胃癌轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的生物學過程，主要通過直接蔓延、淋巴道轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移方式發(fā)生，其中胃癌細胞穿越基底膜在胃癌轉(zhuǎn)移的過程中至關(guān)重要。Burkitt等[6]研究表明，胃泌素可通過MAPK 依賴性信號途徑使MMP表達水平升高，而MMP對細胞外基質(zhì)及基底膜的降解效應(yīng)促進了胃癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移。Takaishi等[7]在研究幽門螺桿菌感染、胃泌素及胃癌的關(guān)系指出，幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃癌的發(fā)生發(fā)展中，胃泌素是其輔助因子。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)：經(jīng)幽門螺桿菌毒素相關(guān)蛋白CagA干預(yù)后的胃癌細胞株AGS、SGC-7901中，CagA上調(diào)胃泌素基因的表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)胃癌標本中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組胃泌素基因的表達水平是原發(fā)腫瘤的42倍，由此推測上調(diào)的胃泌素表達可能與胃癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-9]。

Figure 4. The invasion of SGC-7901 and AGS cells after gastrin treatment determined by Transwell assay (crystal violet staining,×400).Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 nmol/L;##P<0.05vs10 nmol/L.

圖4Transwell小室實驗檢測胃泌素處理后SGC-7901和AGS細胞的侵襲及其細胞計數(shù)結(jié)果

表1胃泌素對胃癌細胞分泌MMP-2的影響

Table 1. Effects of gastrin on the secretion of MMP- 2 in gastric cancer cells [mg/(g protein).Mean±SD.n=6]

GroupAGScellsSGC-7901cellsControl65.609±4.74082.328±1.97010nmol/Lgastrin76.291±3.213*90.357±3.310*100nmol/Lgastrin72.733±1.999*88.263±0.531*

*P<0.05vscontrol group.

Transwell 小室實驗和細胞劃痕實驗已被國內(nèi)外眾多學者用于腫瘤細胞遷移和侵襲的研究[10]。本研究首先通過細胞劃痕和Transwell小室遷移實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃泌素處理后，細胞遷移能力顯著增強，Transwell下室中遷移細胞數(shù)顯著高于對照組的細胞數(shù)，且隨著胃泌素濃度的增高，細胞遷移數(shù)相應(yīng)增加，說明胃泌素以劑量依賴的方式增強胃癌細胞的遷移能力。隨后本研究又通過Transwell小室侵襲實驗證實，經(jīng)10 nmol/L與100 nmol/L胃泌素處理胃癌細胞后，Transwell下室中侵襲細胞數(shù)顯著高于未經(jīng)胃泌素處理的細胞，且隨胃泌素濃度的增加侵襲細胞數(shù)也增加，說明胃泌素能增強胃癌細胞的侵襲能力。本研究還發(fā)現(xiàn)胃泌素以劑量依賴的方式增強胃癌細胞的增殖能力，為細胞的遷移和侵襲提供細胞來源。

胃癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的首要條件是穿越細胞外基質(zhì)和基底膜，而MMPs等多個因子參與了該過程。MMPs屬于鋅依賴性蛋白酶超家族，它們能降解內(nèi)皮細胞外基質(zhì)及血管基底膜，促進腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。其中MMP- 2可降解細胞外基質(zhì)和血管基膜的主要成分Ⅳ型膠原，使腫瘤細胞易于脫離癌細胞巢，進出血管從而促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。有學者的研究發(fā)現(xiàn)，MMP- 2的表達與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和腫瘤的分期呈正相關(guān)[11]。本研究顯示胃泌素以劑量依賴的方式增強胃癌細胞分泌MMP- 2能力，可能是胃泌素促進胃癌細胞在體外遷移和侵襲的重要機制。也有學者發(fā)現(xiàn)隨著胃泌素作用時間的延長和劑量的增加，細胞中MMP-7的基因表達量也隨之上調(diào)，進而推測胃泌素可利用該機制促進胃癌細胞轉(zhuǎn)移[12]。

[1] Hotta K，Oyama T, Akamatsu T, et al. A comparison of outcomes of endoscopic submucosal dissection (ESD) for early gastric neoplasms between high-volume and low-volume centers: multi-center retrospective questionnaire study conducted by the Nagano ESD Study Group[J]. Intern Med, 2010, 49(4): 253- 259.

[2] 孫為豪，曹大中，俞 謙，等. 胃泌素對大鼠胃粘膜環(huán)氧合酶及生長因子表達的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2005, 21(2): 271- 275.

[3] Iwasa K, Evers BM, Hellmich MR, et al. Regulation of growth of human gastric cancer by gastrin and glycine-extended progastrin[J]. Gastroenterology, 1997, 113(3): 782-790.

[4] Soh UJ, Dores MR, Chen B, et al. Signal transduction by protease-activated receptors[J]. Br J Pharmacol, 2010, 160(2): 191-203.

[5] 張淑杰，王瑞芬. 胃腸道類癌組織中胃泌素、生長抑素等表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究[J]. 哈爾濱醫(yī)科大學學報, 2007, 41(4): 356-358.

[6] Burkitt MD, Varro A, Pritchard DM. Importance of gastrin in the pathogenesis and treatment of gastric tumors[J]. World J Gastroenterol, 2009, 15(1): 1-16.

[7] Takaishi S, Tu S, Dubeykovskaya ZA, et al. Gastrin is an essential cofactor for helicobacter-associated gastric corpus carcinogenesis in C57BL/6 mice[J]. Am J Pathol,2009, 175(1): 365-375.

[8] 汪 蘇，周建獎，單可人，等. 幽門螺桿菌毒素相關(guān)蛋白CagA上調(diào)胃泌素基因表達[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 2009, 29(11): 976-980.

[9] Zhou JJ, Xie Y, Zhao Y, et al. Human gastrin mRNA expression up-regulated byHelicobacterpyloriCagA through MEK/ERK and JAK2-signaling pathways in gastric cancer cells[J]. Gastric Cancer, 2011, 14(4): 322-331.

[10] 施小宇, 陶思豐, 陳 力，等. 小干擾RNA 抑制CD97 的表達及其對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(7): 1285-1289.

[11] Zheng H, Takahashi H, Murai Y, et al. Expressions of MMP- 2, MMP-9 and VEGF are closely linked to growth, invasion, metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma[J]. Anticancer Res, 2006, 26(5A): 3579-3583.

[12] Mishra P, Senthivinayaqam S, Rangasamy V, et al. Mixed lineage kinase-3/JNK1 axis promotes migration of human gastric cancer cells following gastrin stimulation[J]. Mol Endocrinol, 2010, 24(3): 598- 607.

Gastrinpromotesthemigrationandinvasionofgastriccancercells

LIU Jun1, ZHOU Jian-jiang1, 2, ZHAO Yan1, XIE Yuan1

(1KeyLaboratoryofMolecularBiology,2ClinicalLaboratoryofAffiliatedHospital,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.E-mail:jianjiangzhou@sina.cn)

AIM: To study the effects of gastrin on the migration and invasion of gastric cancer cellsinvitro.METHODSThe migration and invasion of gastric cancer AGS and SGC-7901 cells after treated with gastrin at concentrations of 10 nmol/L and 100 nmol/L were studied by wound-healing assay and Transwell migration and invasion assay. The cell proliferation was analyzed by MTT colorimetric method. The concentration of matrix metalloproteinase 2 (MMP- 2) in the culture medium was detected by ELISA. The AGS and SGC-7901 cells without treating with gastrin served as control cells.RESULTSCompared with the control cells, the migration and invasion of AGS cells and SGC-7901 cells were significantly increased after treated with gastrin at concentrations of 10 nmol/L and 100 nmol/L. In control, 10 nmol/L gastrin and 100 nmol/L gastrin groups, the mean numbers of the migrating cells were 56.0, 88.1 and 106.4/view in AGS cells and 52.8, 91.0 and 113.3/view in SGC-7901 cells, and the mean numbers of the invasive cells were 78.4, 118.7 and 141.6/view in AGS cells and 87.3, 124.6 and 147.4/view in SGC-7901 cells, respectively. The numbers of the migrating cells and invasive cells in 100 nmol/L gastrin group were higher than those in 10 nmol/L gastrin group. The cell proliferation rate and the concentration of MMP- 2 in the culture medium in gastrin treatment groups were higher than those in control group.CONCLUSIONGastrin promotes the migration and invasion of gastric cancer cells in a dose-dependent manner by increasing the MMP- 2 secretion, which may be the key mechanism in the proliferation, invasion and metastasis of the cancer cellsinvivo.

Gastrin; Stomach neoplasms; Matrix metalloproteinase 2

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.027

1000- 4718(2013)04- 0730- 05

2012- 10- 27

2013- 03- 18

國家自然科學基金資助項目(No. 31060122)；貴州省科技攻關(guān)計劃基金資助項目(No. 黔科合SY字[2011]3067號)；貴州省科學技術(shù)基金資助項目(No. 黔科合J字[2012]2039號)

△通訊作者 Tel： 0851- 6752814； E-mail： jianjiangzhou@sina.cn