曾力群 ，沈長(zhǎng)銀 ， 任 騰， 袁正強(qiáng)， 劉 丹

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563002； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響

曾力群1，沈長(zhǎng)銀2， 任 騰1， 袁正強(qiáng)1， 劉 丹1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563002； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

目的觀察硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響。方法培養(yǎng)兔血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)3～8代，分為對(duì)照組、硫化氫組、阿托伐他汀鈣組以及硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣組(簡(jiǎn)稱聯(lián)合干預(yù)組)，共4組，分別給予相應(yīng)干預(yù)，TUNEL法檢測(cè)VSMCs的凋亡情況。結(jié)果VSMCs凋亡率：與對(duì)照組相比，硫化氫組、阿托伐他汀鈣組以及聯(lián)合干預(yù)組VSMCs的凋亡率均增加(P<0.01)；與硫化氫組相比，聯(lián)合干預(yù)組VSMCs凋亡率增加(P<0.01)，阿托伐他汀鈣組VSMCs凋亡率減少(P<0.01)。結(jié)論硫化氫、阿托伐他汀鈣以及兩者聯(lián)合均可促進(jìn)VSMCs的凋亡，其中以兩者聯(lián)合效果最為明顯，硫化氫的作用強(qiáng)于阿托伐他汀鈣。

血管平滑肌細(xì)胞凋亡；硫化氫;阿托伐他汀鈣

硫化氫因其具有臭雞蛋氣味一直以來(lái)被認(rèn)為是一種有毒物質(zhì)，直到2002年Rui Wang等[1]報(bào)道硫化氫可能是繼NO、CO的第3類內(nèi)源性生理性氣體信號(hào)分子，在干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化(artery atherosclerosis,AS)研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其作用尤其表現(xiàn)在抑制血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖，誘導(dǎo)其凋亡方面[2]。阿托伐他汀鈣是人工合成的羥甲基戊二酸單酰輔酶A(hydroxy methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶抑制劑。目前阿托伐他汀鈣因其具有調(diào)脂的作用，而用于心腦血管AS性疾病等的治療中[3]。VSMCs增殖是AS性疾病形成的重要一環(huán)，阿托伐他汀鈣是否可以抑制VSMCs增殖，誘導(dǎo)其凋亡尚存在爭(zhēng)議，另外硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣對(duì)VSMCs生長(zhǎng)的影響以及機(jī)制國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察硫化氫聯(lián)合阿托伐他汀鈣對(duì)VSMCs生長(zhǎng)的影響，探討兩者聯(lián)合對(duì)AS形成可能存在的新的藥理作用機(jī)制，為抗AS藥物的研究以及臨床治療提供進(jìn)一步的幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康雄性大白兔，平均體重2.2±0.4 kg(遵義醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)將3～8代VSMCs做成細(xì)胞爬片，待細(xì)胞融合后開(kāi)始干預(yù)，分為4組：A 對(duì)照組：2 mL培養(yǎng)液；B 阿托伐他汀鈣組：濃度為1×10-6mol/L的阿托伐他汀鈣1 mL+培養(yǎng)液1 mL干預(yù)培養(yǎng)的VSMCs；C 硫化氫組：濃度為1×10-6mol/L的硫氫化鈉1 mL+培養(yǎng)液1 mL干預(yù)培養(yǎng)的VSMCs；D 聯(lián)合干預(yù)組：濃度為1×10-6mol/L的硫化氫1 mL+濃度為1×10-6mol/L阿托伐他汀鈣1 mL干預(yù)培養(yǎng)的VSMCs。

1.2 VSMCs原代培養(yǎng) 空氣栓塞法處死兔子，無(wú)菌操作下取出胸主動(dòng)脈, 立即置于盛有PBS的培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)入經(jīng)過(guò)紫外線滅菌超凈工作臺(tái)內(nèi), 用PBS反復(fù)漂洗血管, 移入盛有20%胎牛血清以及雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中， 棄去血管外膜, 將血管中膜移入另一盛有完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用虹膜剪反復(fù)剪切中膜成針尖樣大小，把組織塊移入培養(yǎng)瓶中，以約5 mm間距將組織塊均勻貼于瓶底，將培養(yǎng)瓶直立沿著瓶側(cè)壁注入2.5 mL完全培養(yǎng)液，蓋上瓶蓋，將瓶底朝上放入37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，擰松瓶蓋使得氣體可自由進(jìn)入瓶中，絕對(duì)靜置4～5 h后組織塊與瓶底貼服不易移動(dòng)，將培養(yǎng)瓶慢慢翻平，使得培養(yǎng)液完全浸沒(méi)組織塊，絕對(duì)靜置孵育4～5 d。見(jiàn)有呈梭形細(xì)胞從組織塊邊緣游出后更換培養(yǎng)液, 每2天換液1次, 半量或2 /3量換液。

1.3 VSMCs傳代培養(yǎng) 當(dāng)大部分組織塊長(zhǎng)出細(xì)胞暈, 相互間融合占培養(yǎng)瓶70%～80%時(shí)即可傳代。吸棄培養(yǎng)液, 用PBS液清洗生長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶瓶底2 次, 再向瓶底加入2～3滴0.25% 胰蛋白酶液，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，見(jiàn)細(xì)胞收縮變圓，有的細(xì)胞漂浮后立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入2 mL完全培養(yǎng)液完全終止消化，并用吸管反復(fù)吹打瓶壁使細(xì)胞脫落，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)入離心管中, 1000 r/min離心5 min，倒掉上清液, 加入完全培養(yǎng)液2.5 mL, 吹打成細(xì)胞懸液, 鏡下計(jì)數(shù)使接種細(xì)胞密度保持于1×106/L，繼續(xù)37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況，隔天換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)再傳代，組織塊隨第1次傳代以及之前的換液而去除。

1.4 VSMCs的鑒定 細(xì)胞免疫化學(xué)染色：將3～5代細(xì)胞做成細(xì)胞爬片，待細(xì)胞融合后棄培養(yǎng)液, PBS洗滌5 min×2次；4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗滌5 min×2次；0.3% Triton- X- 100孵育30 min，以增加細(xì)胞膜的抗原通透性,用PBS洗滌5 min×2次；3%H2O2去離子水孵育10 min，用PBS洗滌5 min×2次；鼠抗兔α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(1:300)4℃孵育，過(guò)夜，第2天復(fù)溫 37℃，45 min，用PBS洗滌5 min×2次；山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體37℃孵育，30 min，用PBS洗滌5 min×2次；DAB染色約5 min(在顯微鏡下觀察染色情況，待鏡下見(jiàn)棕色)立即用PBS洗滌；蘇木素復(fù)染15 min(顯微鏡下見(jiàn)核染成深藍(lán)色)，自來(lái)水沖洗，鹽酸酒精返藍(lán)，梯度酒精以及二甲苯脫水?？靖伞⒂梅馄瑒┓馄?。

1.5 檢測(cè)VSMCs凋亡 分組干預(yù)后24 h后用凱基一步法TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組VSMCs凋亡情況，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs的原代培養(yǎng) 在倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)3～5 d后見(jiàn)少量細(xì)胞從組織塊周圍游出，大小不等，形態(tài)各異(梭形、不規(guī)則形、多角形)，可見(jiàn)少量成“鋪路石”樣改變的內(nèi)皮細(xì)胞。再絕對(duì)靜置3～5 d見(jiàn)細(xì)胞增多，組織塊之間的細(xì)胞匯合，多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)呈梭形，平行排列成單層，部分區(qū)域可見(jiàn)細(xì)胞疊層排列，高低起伏，形成典型的“峰-谷”現(xiàn)象。

2.2 VSMCs的傳代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)后細(xì)胞的形態(tài)更趨向一致，呈梭形，按照接種密度為1×106/L傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，隔天換液1次，3 d即可鋪滿培養(yǎng)瓶底70%～80%,即可傳代。

2.3 VSMCs的鑒定 用第6代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色后，在高倍顯微鏡下見(jiàn)蘇木素將胞核染成紫色，呈卵圓形居于細(xì)胞中央，胞質(zhì)內(nèi)有大量被染成棕色與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維細(xì)絲，即α-平滑肌肌動(dòng)蛋白絲。

2.4 VSMCs凋亡的檢測(cè) 熒光顯微鏡觀察，淡綠色熒光為正常細(xì)胞，黃綠色熒光則為凋亡細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)同一視野熒光顯微鏡下總的細(xì)胞數(shù)以及凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù)。與對(duì)照組相比，硫化氫組、阿托伐他汀鈣組以及聯(lián)合干預(yù)組VSMCs的凋亡率均增加(P<0.01)；與硫化氫組相比，聯(lián)合干預(yù)組VSMCs凋亡率增加(P<0.01)，阿托伐他汀鈣組VSMCs凋亡率減少(P<0.01)(見(jiàn)表1，圖1)。

分組正常細(xì)胞數(shù)(個(gè))凋亡細(xì)胞數(shù)(個(gè))VSMCs凋亡率%對(duì)照組117．22±3．965．67±1．414．84±1．23硫化氫組118．78±8．7254．22±2．59a45．91±4．56a阿托伐他汀鈣組118．00±4．9733．11±3．75ab28．07±3．14ab聯(lián)合干預(yù)組117．64±5．8466．22±5．63ab66．88±5．12ab

注： 與對(duì)照組相比，aP<0.01；與硫化氫組相比，bP<0.01。

注：箭頭所指即為凋亡細(xì)胞A：對(duì)照組；B：硫化氫組；C：阿托伐他汀鈣組；D：聯(lián)合干預(yù)組。 圖1 TUNEL法檢測(cè)各組平滑肌細(xì)胞的凋亡(×200)

3 討論

VSMCs存在于血管中膜, 是構(gòu)成血管并維持其正常生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ), 是決定血管活性、血管構(gòu)型及維持血管張力的重要因素。VSMCs的代謝、功能的改變、表型轉(zhuǎn)化、異常增殖、遷移與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、動(dòng)脈成形術(shù)后血管再狹窄等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而VSMCs體外培養(yǎng)是研究上述疾病和篩選相關(guān)治療藥物中必不可少的環(huán)節(jié)。目前, 原代培養(yǎng)VSMCs的方法主要有酶消化培養(yǎng)法和組織貼壁法。本實(shí)驗(yàn)采用組織貼壁法，通過(guò)細(xì)胞免疫組化染色進(jìn)行鑒定，顯示成功培養(yǎng)出了VSMCs。

既往的研究表明硫化氫可通過(guò)激活ERK和p21Cip/WAK-1的活性，來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的目的，研究的進(jìn)一步深入發(fā)現(xiàn)，硫化氫是通過(guò)使ERK和p21Cip/WAK-1磷酸化，激活了caspase-3的活性誘導(dǎo)HASMCs的凋亡[4]。Li等[5]研究硫化氫對(duì)肺動(dòng)脈高壓時(shí)PASMCs凋亡的影響，用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，免疫化學(xué)染色檢測(cè)PASMCs中Fas,bcl-2和caspase-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)硫化氫通過(guò)激活Fas通路，抑制bcl-2通路，誘導(dǎo)PASMCs的凋亡。NF-κB是一種凋亡轉(zhuǎn)錄因子，Sen N等人新證實(shí)了催化生成硫化氫的CSE具有調(diào)節(jié)NF-κB的活性的作用[6]。關(guān)于他汀類藥物抑制細(xì)胞增殖的作用，Diehtl等[7]研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞因子和VSMCs中NF-κB 的活性, 起到抗炎、抗增殖的作用。Min Li等[8]發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可抑制VSMCs細(xì)胞核的有絲分裂、遷移，從而誘導(dǎo)凋亡。Xu等[9]體外培養(yǎng)VSMCs，通過(guò)檢測(cè)VSMCs凋亡率和VSMCs中的生存素(Survivin)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀鈣組VSMCs凋亡顯著增加，且和劑量以及時(shí)間呈正比，VSMCs中Survivin 6h開(kāi)始下降，24～48h消失。故可以認(rèn)為阿托伐他汀鈣通過(guò)抑制Survivin的表達(dá)而誘導(dǎo)VSMCs的凋亡。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了硫化氫、阿托伐他汀鈣，均具有促進(jìn)VSMCs凋亡的作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合干預(yù)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡的作用更明顯。硫化氫可能是通過(guò)上述的磷酸化ERK和p21(Cip/ WAK-1)，激活NF-κB活性等來(lái)抑制VSMCs的增殖，誘導(dǎo)其凋亡；阿托伐他汀鈣可能是通過(guò)激活凋亡基因Fas、抑制Survivin的表達(dá)、激活NF-κB活性等來(lái)抑制VSMCs的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，故兩者聯(lián)合干預(yù)不僅加強(qiáng)了NF-κB活性，還分別從激活凋亡基因Fas、抑制Survivin的表達(dá)、磷酸化ERK和p21Cip/WAK-1等多個(gè)環(huán)節(jié)疊加作用，從而聯(lián)合干預(yù)VSMCs的凋亡率是最高的。

[1] Wang,R.Two′s company, three's a crowd:Can H2S be the third endogenous gaseous transmitter[J]. FASEB J,2002，16(13):1792-1798.

[2] Lavu M, Bhushan S, Lefer D J.Hydrogen sulfide-mediated cardioprotection: mechanisms and therapeutic potential[J].Clin Sci (Lond),2011，120(6):219-229.

[3] Liu B, Cao H M, Li G Y, et al.Effects of rosuvastatin versus atorvastatin on rho-associated coiled-coil containing protein kinase activity and endothelial function in patients with atherosclerosis[J].J Int Med Res,2011，39(6):2314-2322.

[4] Yang G,Sun X,Wang R.Hydrogen sulfide-induced apoptosis of human aorta smooth muscle cells via the activation of mitogen-activated protein kinases and caspase-3[J].FASEB J,2004， 18(14).1782-1784.

[5] Li W, Jin H F,Liu D,et al.Hydrogen sulfide induces apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cell in rats with pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow[J].Chin Med J (Engl),2009，122(24):3032-3038.

[6] Sen N, Paul B D, Gadalla M M, et al.Hydrogen sulfide-linked sulfhydration of NF-κB mediates its antiapoptotic actions[J].Mol Cell,2012，45(1):13-24.

[7] Dichtl W, Dulak J , Frick M, et al. HMG-CoA reductase Inhibitors regulate Inflammatory.transcription factors in human endothelial and vascular smooth muscle cells[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003，23 (1):58-63.

[8] Li M,Liu Y,Dutt P,et al.Inhibition of serotonin-induced mitogenesis, migration, and ERK MAPK nuclear translocation in vascular smooth muscle cells by atorvastatin[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2007,293(2):463-471.

[9] Xu Y G, Zhou S H,Li Y G,et al.The mechanism underlying vascular smooth muscle cell apoptosis induced by atorvastatin may be mainly associated with down-regulation of survivin expression[J].Cardiovasc Drugs Ther,2007,21(3):145-153.

[收稿2013-10-31;修回2013-11-20]

(編輯：譚秀榮)

Effectofhydrogensulfideandatorvastatincalciumonrabbitsvascularsmoothmusclecells

Zengliqun1，Shenchangyin2，Renteng1，Yuanzhengqiang1，Liudan1

(1.Department of Cardiology,The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563002,China；2. Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo explored the effect of hydrogen sulfide (H2S) and atorvastatin calcium on apoptosis of rabbits vascular smooth muscle cells.MethodsCultured vascular smooth muscle cells (3-8 generations),were divided into 4 groups:control groups, H2S group,atorvastatin calcium group,the combination group. Vascular smooth muscle cells apoptosis was examined after 24 hours using TUNEL assay.Resultscompared with the control group, H2S group, atorvastatin calcium group, the combination group had increase vascular smooth muscle cells apoptosis (P<0.01); compared with H2S group, the combine group had increased vascular smooth muscle cells apoptosis, atorvastatin calcium group had reduced vascular smooth muscle cells apoptosis (P<0.01).ConclusionH2S, atorvastatin calcium and the combination of both can accelerate vascular smooth muscle cells apoptosis. The combination of both is the best, and the effect of H2S is better than atorvastatin calcium.

smooth muscle cells apoptosis; hydrogen sulfide; atorvastatin calcium

R363

A

1000-2715(2013)06-0542-04