葡萄酒中赭曲霉毒素A檢測方法優(yōu)化

龐世琦 ，劉 青,＊，李志勇，潘丙珍，羅 敏，劉 茜， 陳文銳

(1.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.南海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 佛山 528200)

葡萄酒中赭曲霉毒素A檢測方法優(yōu)化

龐世琦1，劉 青1,＊，李志勇1，潘丙珍1，羅 敏2，劉 茜1， 陳文銳1

(1.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.南海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 佛山 528200)

對葡萄酒中赭曲霉毒素A(OTA)的前處理和檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，分別采用液液萃取和免疫親合柱前處理，結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(HPLC-FD)和酶聯(lián)免疫法檢測(ELISA )對OTA的回收率、檢測成本、檢測效率及環(huán)保性進(jìn)行比較，選出適用于大批量樣品篩查的首選方法。同時(shí)針對目前大量進(jìn)口的法國、西班牙、意大利、澳大利亞等國家以及國產(chǎn)的葡萄酒進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：大批量葡萄酒樣品的篩查建議采用液液萃取前處理結(jié)合ELISA方法進(jìn)行檢測的組合作為首選，檢測到陽性樣品時(shí)再用免疫親和柱凈化后用高效液相色譜檢測進(jìn)行確證，方 法具有快捷、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，回收率、精密度都能達(dá)到檢測要求。

赭曲霉毒素A；葡萄酒；高效液相色譜法；酶聯(lián)免疫吸附測定法；方法優(yōu)化

赭曲霉毒素是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌種產(chǎn)生的二級(jí)有毒代謝產(chǎn)物，包含7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中赭曲霉毒素A(ochratoxi n A，OTA)在自然界中分布最廣泛，毒性最強(qiáng)，對人類和動(dòng)植物影響最大。OTA是一種穩(wěn)定的無色結(jié)晶化合物，具有耐熱性，易溶于稀 的碳酸氫鈉溶液和極性有機(jī)溶劑，微溶于水，在紫外照射下呈綠色熒光。研究表明，OTA不僅具有免疫毒性、腎毒性和肝毒性，并且還有致 畸、致突變和致癌作用[1]，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將其定義為group 2B類致癌物[2]。在葡萄酒的種植和釀制過程中，由于受種植環(huán)境和生產(chǎn)工藝、條件的影響，很容易造成赭曲霉毒素的污染。葡萄酒中OTA的檢測越來越受到世界各國的重視。

現(xiàn)有的OTA檢測方法主要有液相色譜-熒光檢測法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測法等[3-8]。由于葡萄酒中的OTA含量較低(一般在0.1～5.0 μg/L)，考慮到其成分復(fù)雜，可能會(huì)對目標(biāo)檢測物產(chǎn)生干擾，一般需要采用富集凈化技術(shù)對樣品進(jìn)行前處理。目前使用的主要凈化技術(shù)有：溶劑提取法、免疫親和柱凈化(immunoaffinity column ，IAC)法和固相萃取(solid-phase extraction ，SPE)法[9-10]。采用IAC或SPE處理后，OTA富集程度高、本底純凈，但成本較高，不太適用于大批量葡萄酒樣品的檢測[11-12]。隨著葡萄酒進(jìn)口量的逐年遞增，如何準(zhǔn)確快速地檢測大批量樣品中OTA的含量是現(xiàn)階段監(jiān)管工作中亟需解決的重點(diǎn)問題之一。

本實(shí)驗(yàn)分別從前處理凈化和檢測兩個(gè)方面對葡萄酒中OTA的檢測方法進(jìn)行優(yōu)化。比較液液萃取和免疫親和柱法對OTA的富集與純化的效果；以及高效液相色譜-熒光檢測(high performance liquid chromatography- fluorescence detection，HPLC-FD)法和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelinked immuno sorbent assay ，ELISA)的檢測效果，并通過優(yōu)化組合，以期選出能夠滿足實(shí)際檢測需求、降低檢測成本、提高檢測效率的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

10.01 μg/mL赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液 Romer國際貿(mào)易(北京)有限公司；甲醇(色譜純)；二氯甲烷、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、冰乙酸、碳酸氫鈉均為分析純；赭曲霉毒素ELISA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒德國拜發(fā)公司。

e2695型高效液相色譜儀(配備熒光檢測器) 美國Waters公司；Ultimate C18柱(4.6mm×250mm ，5μm)；RMS.3振蕩器 德國IKA公司；3-16PK冷凍離心機(jī)美國Sigma公司；氮吹濃縮儀 美國Caliper公司；赭曲霉毒素免疫親和柱 德國拜發(fā)公司；Chem Well全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國Awareness公司。

1.2 方法

1.2.1 HPLC-FD法檢測OTA

1.2.1.1 樣品前處理

免疫親和柱 凈化：吸取15.0mL樣品，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.5，與pH7.5的0.4mol/L磷酸鹽緩沖液(60.0g磷酸氫二鈉，8.8g磷酸二氫鈉定容至1000mL)等體積充分混合后放入離心機(jī)(4000r/min)離心10min。取20.0mL上清液，以2mL/min的速率過免疫親和柱，用10mL 10mmol/L 磷酸鹽緩沖液和10mL吐溫溶液(試劑盒自帶)各淋洗1次，2.0mL甲醇洗脫、過濾后備用。

液液萃取凈化：依次吸取5.0mL樣品、2.5mL 1mol/L鹽酸溶液、4.0mL二氯甲烷于50mL離心管中，充分混合后放入離心機(jī)(4500r/min)離心10min，移取2.0mL下層有機(jī)相于吹氮管中，60℃緩慢氮吹濃縮。用1.0mL 0.13mol/L 碳酸氫鈉溶液溶解殘余物，過濾備用。

1.2.1.2 色譜條件

色譜柱：Ultimate C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1.0mL/min；熒光檢測器：激發(fā)波長333nm，發(fā)射波長460nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL；流動(dòng)相體積比：A為水-冰乙酸(99:1，V/V)，B為乙腈-冰乙酸(99:1，V/V)。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確移取赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成0.100mg/mL溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：根據(jù)需要移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋，分別配制成2.0、5.0、10.0、20.0、25.0 μg/L和50.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見圖1。

1.2.2 ELISA法檢測OTA

1.2.2.1 免疫親和柱凈化

樣品經(jīng)免疫親和柱凈化后，取濾液100 μL與200 μL去離子水混合，再取混合液100 μL與900 μL的0.13mol/L碳酸氫鈉溶液混合均勻，每孔取50μL按測試盒的要求進(jìn)行檢測。

1.2.2.2 液液萃取凈化

樣品經(jīng)液液萃取凈化后，取濾液50 μL與450 μL的0.13mol/L碳酸氫鈉溶液混合均勻，每孔取50 μL，按測試盒的要求進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)資料[13-26]，從樣品的前處理凈化和檢測方面考慮，設(shè)定不同的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行討論。

2.1.1 凈化方式的選擇

液液萃取和免疫親和柱凈化是實(shí)驗(yàn)室常用的毒素檢測凈化手段。本實(shí)驗(yàn)使用免疫親和柱凈化時(shí)，OTA的回收率在91%～107%之間，圖譜見圖2；使用液液萃取法時(shí)回收率在94%～119%之間，圖譜見圖3。由圖2、3可知，兩種前處理方法的檢測效果差異不大，如果從時(shí)間、經(jīng)濟(jì)的角度考慮，可首選液液萃取。

2.1.2 萃取溶劑的選擇

結(jié)合OTA的化學(xué)特性，分別采用二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳對質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0 μg/L 3個(gè)水平的加標(biāo)葡萄酒進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，用二氯甲烷萃取的平均回收率為91.9%、三氯甲烷萃取為78.2%、四氯化碳為65%左右?？紤]到二氯甲烷的毒性略小，因此建議選用二氯甲烷作為萃取劑。

2.1.3 淋洗溶劑的選擇

目標(biāo)檢測物在免疫親和柱富集后，可采用水、磷酸緩沖液、吐溫溶液等來淋洗，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，依次用磷酸緩沖液、吐溫溶液淋洗，可得到更好的凈化效果。

2.1.4 洗脫溶液的選擇

免疫親和柱凈化后需要用甲醇與酸的混合液洗脫富集在柱上的目標(biāo)物，但ELISA檢測要求試液的pH值在7.5左右，因此分別用甲醇-冰乙酸(98:2，V/V)和純甲醇溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明兩者無明顯的差異，從簡化實(shí)驗(yàn)步驟考慮，選用純甲醇洗脫。

2.2 檢測方法優(yōu)化

HPLC-FD對OTA進(jìn)行檢測時(shí)，流動(dòng)相可分別采用等度或梯度洗脫。等度洗脫過程中，流動(dòng)相為乙腈-水-冰乙酸(58:41:1，V/V)。當(dāng)采用免疫親和柱凈化時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間短、色譜峰形好；但由于葡萄酒的基質(zhì)非常復(fù)雜，當(dāng)采用液液萃取凈化時(shí)，目標(biāo)物的附近有很多的干擾峰，只有采用梯度洗脫，才能達(dá)到良好的分離效果。為比較不同流動(dòng)相的梯度洗脫程序?qū)Ψ蛛x效果的影響，比較了兩種不同的洗脫程序(表1)。從峰形、干擾峰和目標(biāo)峰的分離等結(jié)果表明洗脫程序2較佳。

2.3 方法的線性范圍與檢出限

根據(jù)本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件，用質(zhì)量濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、25.0 μg/L和50.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積對質(zhì)量濃度作圖。結(jié)果表明，目標(biāo)物在2.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)，線性方程為y=8.75×103x＋2.38×103，線性相關(guān)系數(shù)為0.9996，線性良好。當(dāng)樣品中的目標(biāo)物超出此線性范圍時(shí)，可適當(dāng)調(diào)整樣品的稀釋倍數(shù)。

如果凈化后采用ELISA方法檢測，則方法的線性范圍和檢出限要根據(jù)各測試盒的規(guī)定確定。

2.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度

在紅葡萄酒、桃紅葡萄酒、白葡萄酒中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)添加質(zhì)量濃度，分別用經(jīng)免疫親和柱和液液萃取前處理得到的待測液，待測液再分別用HPLCFD法和ELISA法檢測，每種方法每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)6次，獲得回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別見表2～5。

由表2～5可知，兩種凈化手段和兩種檢測方法的回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都能達(dá)到要求。其中前處理方法采用液液萃取較免疫親和柱法的回收率相對偏高，分析可能是由于液液萃取在凈化過程中對干擾物質(zhì)凈化不夠徹底。但液液萃取對實(shí)驗(yàn)條件要求不高、成本低，可適用于大批量葡萄酒樣品中OTA的篩查。ELISA法與HPLC-FD法比較，在回收率、精密度方面沒有很明顯的差別，但ELISA檢測由于其操作簡單、快速、準(zhǔn)確，可大大提高檢測效率，當(dāng)檢測到陽性樣品時(shí)可考慮用液相色譜等其他方法進(jìn)行確證。

2.5 葡萄酒樣品測定

使用液液萃取進(jìn)行前處理，ELISA檢測的組合對法國、西班牙、意大利、智利、澳大利亞、中國等14個(gè)國家的18批次、506支葡萄酒樣品進(jìn)行OTA含量檢測，結(jié)果表明，OTA的含量一般都在0.17～1.60 μg/L之間，符合歐盟和國際葡萄與葡萄酒組織關(guān)于OTA限量小于2.0 μg/L[27]的相關(guān)規(guī)定。其中西班牙酒有2支檢出OTA含量分別為4.632、3.765 μg/L，意大利有2支干紅葡萄酒檢出含量高于1.60 μg/L、有2支甜型葡萄酒含量為4.79 μg/L和2.44 μg/L。對來自中國6個(gè)葡萄酒產(chǎn)區(qū)的50多支葡萄酒進(jìn)行檢測，均未檢出含有OTA。

3 結(jié) 論

從時(shí)間、成本、操作條件等因素考慮，本實(shí)驗(yàn)選用

液液萃取的樣品前處理方法可以很好地凈化樣品，在萃取劑的選擇上，二氯甲烷比三氯甲烷、四氯化碳更為理想。在凈化過程中無論選液液萃取還是過免疫親和柱，檢測方法采用HPLC-FD或ELISA方法，回收率、精密度都能達(dá)到檢測要求。ELISA方法檢測操作簡單、檢測效率高，更適合大批量樣品的初篩。綜上所述，大批量葡萄酒樣品的篩查建議采用液液萃取前處理結(jié)合ELISA方法進(jìn)行檢測的組合作為首選，檢測到陽性樣品時(shí)再用免疫親和柱凈化后用HPLC-FD進(jìn)行確證，這樣的組合方法具有快捷、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可滿足實(shí)際檢測工作的需要。

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An Optimized Procedure for Rapid Determination of Ochratoxin A in Wine

PANG Shi-qi1，LIU Qing1,＊，LI Zhi-yong1，PAN Bing-zhen1，LUO Min2，LIU Xi1，CHEN Wen-rui1
(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guan gzhou 510623, China；2. Nanhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Foshan 5282 00, China)

The purpose of this study was to establish the optimal sample pretreatment pro cedure and analytical m ethod for determining oc hratoxin A (OTA) in wine. Sample pretreatment was achieved by alternative methods , either by liquid-liquid extraction or by immunoaffinity column chromatograp hy (IAC) and two different analytical methods, high-performance liquid chromatography (HPLC) and enzyme-linked immunosorbent as say (ELISA), were compared for their suitability for large-scale determination of OTA in wine from the viewpoint s of OTA recovery, cost, efficiency and environmental protection. The selected analytical procedure was validated by applying it for the determination of wines imported from Fra nce, Spain, Italy and Australia as well as domestic wines. Based on the results of this study, liquid-liquid extraction in combination with ELISA is a more suitable method for large-scal e screening of wines for OTA and can be validated by comparative determination of the positive samples using HPLC an alysis following IAC clean-up. The method proposed in this study is rapid, convenient, sensitive and accurate and mee ts the analytical requirements of recovery and precision .

ochratoxin A；wine；high performance liquid chromatography (HPLC) ；enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA)；optimization

TS261.7

A

1002-6630(2013)24-0193-04

10.7506/spkx1002-6630-201324040

2012-12-02

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B050400025；2010B020316006)；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(20121 0104-2)；廣東檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013GDK31)

龐世琦(1976—)，女，工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測。E-mail：psqciq@163.com

＊通信作者：劉青(1971—)，女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測。E-mail：liuq@iqtc.cn